Kümeler ne kadar büyükse, o kadar ağırdırlar ve ışık yolundan düştüklerinde ışığın daha yüksek iletimi algılanır. ADP, adrenalin, kollajen ve antibiyotik ristosetin dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan birkaç agonist vardır. Ristocetin, trombositler üzerinde doğrudan bir etkisi olmadığı, ancak von Willebrand faktörü olarak bilinen faktör VIII kompleksinin bir kısmını değiştirdiği için alışılmadık bir agonisttir.
Modifiye edildiğinde, bu protein küresel bir yapıdan doğrusal bir yapıya dönüşür. Doğrusal yapı daha sonra birkaç trombosite bağlanır ve psödoagregasyon verir. Von Willebrand proteininde nicel ve nitel değişiklikler olan hastalarda ristocetine anormal bir yanıt görülür.
Trombosit Fonksiyon Analizörü PFA-100
PFA 100 cihazı (Dade), kolajen/epinefrinin neden olduğu kapanma süresini ölçmek için rutin laboratuvarlarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. Cihaz, kesme gerilimi altında kolajen kaplı bir kapiler üzerinde trombosit tıkacı oluşumunu ölçer. Sitratlı venöz kan, epinefrinle kaplı bir zarla temas etmek için bir kılcal borudan çekilir ve trombosit aktivasyonu ile sonuçlanır.
Kan daha sonra zardaki hassas bir açıklıktan aspire edilirken trombositler açıklığı kapatmak için sabit bir tıkaç oluşana kadar çevreye yapışmaya başlar. Bu nedenle kapanma süresi, kanın açıklıktan geçmesini durdurmak için geçen süredir ve ex vivo trombosit tıkacı oluşumunun bir ölçüsüdür. Bu metodoloji artık birçok laboratuvar için trombosit araştırmalarının ilk aşamasını temsil etmektedir.
Trombosit Salınımına Yönelik Araştırmalar
Trombosit salınımını inceleyen teknikler, radyoizotop kullananlar ve lusiferinaz enzimini kullanarak ışık üretimini kullananlar olarak ikiye ayrılabilir. İzo-konu teknikleri iki şekilde gerçekleştirilebilir.
Trombositler, 5-HT salınımını aramak için 14C etiketli 5-hidroksitriptamin (5-HT) gibi araştırılan moleküle dahil edilebilecek bir radyoizotop ile inkübe edilebilir. Bu yöntemlerde, trombosit açısından zengin plazma, ilgili bir radyoaktif bileşik ile bir süre inkübe edilir.
Trombositler daha sonra plazmadan ayrılır ve fazla radyoizotop uzaklaştırılır. Bunu yapmak için trombositler bir albümin yoğunluk gradyanından geçirilerek trombosit peletini altta, radyoaktif plazma üstte kalacak şekilde döndürülür. Trombosit peleti daha sonra bir tampon içinde yeniden süspanse edilir, tekrar yıkanır ve sayılır.
Güçlü bir agonistle trombosit agregasyonundan sonra, trombositten fakir plazma da sayılır ve trombositten fakir plazmadaki radyoaktivite miktarı, tam trombosit numunesindeki aktivitenin yüzdesi olarak ifade edilir.
Radyoizotopları kullanan ikinci bir teknik, bir radyoimmün tahlili (RIA) gerçekleştirmektir. Bu metodoloji ile incelenen bileşik, aynı bileşiğin bir radyoaktif izleyici ile etiketlenmiş bir kısmı ile karıştırılır. Bu karışıma, araştırılan bileşiğe özel bir and antikor eklenir.
Flow sitometri normal değerler
Flow sitometri cihazı
Flow sitometri cihazı Nedir
Flow sitometri fiyat
Flow sitometri cihaz fiyatları
Flow sitometri kullanım alanları
Flow sitometri Laboratuvarı
Flow sitometri yorumlama
İnkübasyondan sonra, antikora bağlı bileşik bağlanmamış olandan genellikle aktif kömür ilavesi ve ardından santrifüjleme ile ayrılır. Peletteki veya serbest süpernatandaki radyoaktiviteyi saymak mümkündür.
Antikor, radyoetiketli ve radyoetiketlenmemiş numuneleri eşit miktarda bağladığından, antikor tarafından bağlanan radyoaktivite oranı, araştırılan plazmadaki bileşik miktarı ile ters orantılıdır. Yöntem, bir grafik oluşturmak için bilinen kontrol plazma konsantrasyonları kullanılarak nicelendirilir ve ardından numuneler için okumalar grafikten ölçülür.
Kemilüminesans, trombosit salınım reaksiyonunun araştırılmasında kullanılan başka bir tekniktir. Bu, ATP ve lusiferinazın ışık fotonları üretmek için lusiferin üzerinde reaksiyona girdiği ateş böceğinde gerçekleşen aynı kimyasal reaksiyona dayanmaktadır. Reaksiyon, üretilen ATP miktarına bağlıdır.
Trombosit reaksiyonunda, trombosit salma bileşikleri ile birlikte bir reaksiyon şişesine lusiferinaz ve lusiferin eklenir. Reaksiyon şişesindeki ATP miktarı üretilen ışık miktarını belirler. Daha yüksek bir ışık üretimi, trombositlerden daha yüksek bir ATP salınımından kaynaklanır.
Akış Sitometrisi
Akış sitometrisi, trombositlerde eksprese edilen spesifik antijenlere karşı trombosit fonksiyonunu araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Akış sitometrisinin metodolojisi Bölüm 32'de tartışılmaktadır. Trombosit araştırmaları için tanımlanabilecek iki ana protein vardır; trombositin hücre duvarına bağlanması için gerekli olanlar ve trombositlerin birbirine agregasyonu için gerekli olanlar yer alır.
Glikoprotein Ib, trombositlerin von Willebrand faktörü aracılığıyla subendotelyal matrikse bağlanması için gerekli olan bir yüzey antijenidir. Glikoprotein IIb/IIIa, trombosit agregasyon reaksiyonu için gerekli olan ana bileşenlerden biridir. Bu nedenle trombosit fonksiyonundaki bir eksiklik, bu proteinlerden herhangi birine karşı oluşturulan monoklonal antikorlar kullanılarak tanımlanabilir.
Trombosit membrana bağlı glikoproteinlerdeki anormallikleri araştırmak için yavaş santrifüjleme ile trombositten zengin bir plazma hazırlanır. Plazma daha sonra trombositten fakir plazma veya albümin içinde seyreltilerek yaklaşık 1 109=1 trombosit sayısı elde edilir.
Bunun bir alikosu daha sonra glikoproteine özgü floresan etiketli bir monoklonal antikor ile karıştırılır. İnkübasyondan sonra, tüm miktar tekrar yaklaşık 0.5 ml verecek şekilde seyreltilir. Numune daha sonra bir akış sitometresi ile analiz edilir. Pozitiflik için, floresan indeksi, aynı hastanın trombositlerinin florokrom içermeyen bir kontrol örneğinden daha yüksek olmalıdır.
Trombositler, kanın en küçük hücresel bileşenidir ve inceleme altındaki trombositlerin etrafından geçiş yapmak basit olduğundan, kırmızı hücreleri parçalamak veya numuneden herhangi bir kalıntıyı çıkarmak gerekli değildir.
Trombotik bozukluklarda trombositlerin rolüne artan bir ilgi vardır. Bu, trombotik epizodlar sırasında aktive olan trombosit popülasyonlarını belirlemek için trombositlerin araştırılmasına yol açmıştır, örn. protez kalp kapağı değişimlerinden sonra. Aktivasyonun iki ana belirteci tanımlanmıştır.
Biri, özellikle IIb/IIIa olmak üzere membran glikoproteinlerinin konformasyonel şeklindeki değişikliklerden kaynaklanmaktadır. Bu değişiklik, dinlenme trombositinde moleküller üzerindeki bobinler içinde gizlenmiş olan bölgeleri dış ortama maruz bırakır. Bu aktivasyon epitoplarına karşı birçok antikor üretilmiştir.
Bu aktivasyon antijenleri sadece zayıf trombin solüsyonları ile aktive edilmiş trombositlerde gösterilebilir ve tedavi edilmemiş trombositlerde negatiftir. İkinci tip bir aktivasyon proteini, granüllerin parçaları trombositlerin yüzey membranında eksprese edildiğinde tanımlanır.
Bu, granüller salgılama sürecinden geçtiğinde ve granüllerin zarı trombosit dış zarına dahil olduğunda gerçekleşir. Bunlara trombosit aktivasyon kaynaklı granüler dış membran (PAD-GEM) adı verilmiştir.
Bu belirteçlere karşı antikorları tek başına veya kombinasyon halinde kullanarak ve yukarıda açıklanan teknikle bir akış sitometresi kullanarak aktive trombositlerin oranını belirlemek mümkündür.
Deplasman Modeli
NPC’nin tutma mekanizmasına yönelik deneysel araştırmaların çoğu, sabit faz olarak silika kullanılarak gerçekleştirilmiştir, ancak son zamanlarda bu çalışmalar diğer polar bağlı destekleri (amino fazı) içerecek şekilde genişletilmiştir.
Farklı polariteye sahip mobil fazlar kullanılarak yapılan deneysel retansiyon gözlemleri, hareketli faz moleküllerinden oluşan bir tek tabakanın sabit fazın yüzeyine adsorbe edildiğini öne süren bir model önerisi ile sonuçlanmıştır. Ayrıştırılan çözünen, sabit faza bağlanır ve böylece bir veya daha fazla çözücü molekülünün yerini alır (veya birbiriyle rekabet eder).
Sabit fazdaki tutma yerleri, silika için silanol (SOH) grupları, alümina için AlOH ve amino bağlı faz için amino (NH) gruplarıdır. Termodinamik bir yorum, çözünen moleküllerin durağan faz ile etkileşiminin baskın etkileşim olduğu ve çözünen maddenin hareketli faz ile etkileşiminin nispeten önemsiz olduğu sonucuna varır.
Solvent mukavemeti ve tutma süresi arasındaki ilişki aşağıdaki gibi elde edilebilir:
log k {/ log k; = ‘x A, x (E, – E,)
nerede k; ve ki, belirli bir çözünen maddenin iki farklı mobil fazdaki kapasite faktörleridir, a ‘, adsorban yüzeyinin gücünün bir fonksiyonudur ve E1 ve E, farklı mobil fazların çözücü mukavemetinin değerleridir.
Bu nedenle, tutma ve çözücü mukavemeti arasında doğrusal bir ilişki vardır. Çözücü kuvvetine karşı tutma grafiğinin eğimi, çözünen maddenin moleküler kütlesi olan Aı ile orantılıdır.
Bu denklem hem polar olmayan çözücüler hem de çözücüler için doğrulanmıştır ve bu tür grafiklerde meydana gelen sapmaların, daha polar gruplar arasındaki çeşitli etkileşimlerden kaynaklandığı öne sürülmüştür: (a) çözücünün polar grupları kendilerini yüzeye eşit olarak dağıtmamaları (sınırlı erişim yerinin belirlenmesi); (b) çözücü moleküllerinin yanal etkileşimi (saha rekabeti yer değiştirme); ve (c) mobil fazda çözünen ve çözücünün etkileşimi (örneğin, hidrojen bağı).
Bu model aynı zamanda hem alümina hem de amino durağan fazlarda tutulmayı açıklamak için kullanılmıştır. Siyanopropil sabit fazlar, polar olmayan mobil fazlar kullanıldığında (muhtemelen serbest silanol gruplarının varlığından dolayı) sıradan silikaya benzer özellikler gösterir. Daha polar hareketli fazların varlığında, siyano gruplarının baskın reaktif grup olduğu düşünülmektedir.
Matematiksel bir yorum, yer değiştirme modelinin hem silika hem de alümina için tutma sürelerini tahmin etmek için başarılı bir şekilde kullanılabileceği, ancak kimyasal olarak bağlanmış fazlar için çok doğru olmadığı sonucuna varır.
Adsorpsiyon Ders Notları
Freundlich izotermi
Adsorpsiyon Örnekleri
Adsorpsiyonu etkileyen faktörler
Adsorpsiyon termodinamiği
Fiziksel adsorpsiyon
Langmuir izotermi soruları
Adsorpsiyon çeşitleri
Sorpsiyon Modeli
Sorpsiyon modeli, silika yüzeyine adsorbe edilen çözücünün miktarını belirlemek için yapılan çalışmalardan türetilmiştir. Deneysel kanıtlar, silikanın suyu yüzeyine adsorbe ettiğini ve bunların bir kısmı sıralı organik faz ekstraksiyonu olabileceğini göstermektedir. Çok yüksek sıcaklıklarda daha fazlası çıkarılabilir, ancak bu aynı zamanda silanol gruplarının parçalanmasına da neden olur.
Eylemsiz bir çözücüde farklı polar modifiye edicilerin adsorpsiyonunun ölçülmesi, adsorpsiyon izotermlerinin hesaplanmasına izin verir. Değiştiricinin konsantrasyonu düşük olduğunda, izoterm tek tabakalı bir işleve en yakın şekilde oturur. Polar değiştirici yüksek bir konsantrasyonda bulunduğunda, iki tabakalı bir adsorpsiyon izoterm fonksiyonu üretilmektedir:
y = A – (A + ABx / 2) / (z + BX + CX ’)
Bir tekli çözücü tabakasının silika yüzeyine adsorbe edilmesi ve çözünen maddenin, polarite çözücününkinden daha az olduğunda yüzeye adsorbe edilmesi önerilmektedir. Yer değiştirme veya “site rekabeti” öngörülmemektedir.
Polar değiştirici konsantrasyonu yüksek olduğunda, bir çift katman oluşur ve çözünen daha sonra ikinci katmandaki polar çözücünün bir molekülü ile rekabet eder.Bu nedenle, iki model arasındaki en büyük fark, çözünen madde arasındaki etkileşimlere verilen önem seviyesidir.
İki modelin detaylı bir karşılaştırması yapıldı. Bu modellerin her ikisi de çözünen madde tutma ve mobil fazın polaritesi arasındaki ilişkiyi açıklamaya çalışır.
Karma çözücü teorisinin bağımsız bir çalışması sorpsiyon modelini desteklerken, çözücü bileşiminin alkilfenollerin ve naftollerin kromatografisi üzerindeki etkileri üzerine yapılan başka bir çalışma, yer değiştirme modeli lehine kanıtlar göstermektedir.
Şu anda, yer değiştirme modelini desteklemek için daha fazla kanıt sunulmuştur, ancak her ikisi de başarılı bir şekilde
Çeşitli mobil faz parametrelerinin etkilerini tahmin eder.
Sabit Faz Etkileri
NPC için küçük küresel partiküllerin kullanılması, 10.000’den fazla plaka sayısı ile sonuçlanır ve bu, ters fazlı HPLC için şu anda kullanımda olan sabit fazların verimlilikleri ile olumlu bir şekilde karşılaştırılır. NPC’de kullanılan ortak fonksiyonel grupların bir listesi gösterilmektedir.
NPC’de kullanılan popüler desteklerin çoğu, alümina istenmeyen yan reaksiyonlara (örneğin karboksilik asit ile geri dönüşü olmayan reaksiyon) maruz kaldığından silis bazlıdır.
Bağlanmış faz desteklerinin eklenmesi, bazıları ters faz modunda da kullanılabilen diğer birçok kutupsal sabit fazın mevcudiyetine yol açmıştır. Bağlanmış bir diamino fazının aromatik hidrokarbonlar için optimal olduğu bulunmuştur.
Mobil Faz Efektleri
NPC’de, diğer kromatografi modlarında olduğu gibi, mobil faz, tutmayı ve seçiciliği kontrol etmek için kullanılır. Polarite sırasına göre daha yaygın olarak kullanılan çözücülerin bir listesi verilmiştir.
En popüler mobil fazlar, daha polar bir çözücünün çeşitli konsantrasyonlarının eklendiği ya heksan ya da heptan’a dayanmaktadır. NPC’de, mobil fazın gücü artan polarite ile artar, bu da k ‘değerinde buna karşılık gelen bir azalmaya neden olur. (Bu, polaritedeki bir azalmanın k ” de bir azalmaya yol açtığı RPC’de gözlemlenenin tam tersidir.)
Yer değiştirme teorisini desteklemek için, amino bağlı bir kolon kullanılarak log k ‘ve çözücü mukavemeti (Eo) arasında doğrusal bir ilişki gösterilmiştir.
Seçicilik etkileri, durağan faz ile çözünen madde arasındaki mobil faz etkileşimleriyle belirlenir. Proton donörlerini içeren bu mobil fazlar, temel çözünen maddelerle etkileşime girecektir. Tersine, proton verici alıcıları içeren mobil fazlar, asidik çözücülerle güçlü bir şekilde etkileşime girecektir.
Çözünen madde ve mobil aşama arasında aşırı etkileşimlerin meydana geldiği yerlerde, kuyruk oluşumu zirveye çıkabilir. Bununla birlikte, bir bazik modifiye edicinin (trietilamin) dahil edilmesi, bu tür güçlü etkileşimlerin üstesinden gelebilir ve böylece pik şeklini iyileştirebilir.