Kümeler ne kadar büyükse, o kadar ağırdırlar ve ışık yolundan düştüklerinde ışığın daha yüksek iletimi algılanır. ADP, adrenalin, kollajen ve antibiyotik ristosetin dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan birkaç agonist vardır. Ristocetin, trombositler üzerinde doğrudan bir etkisi olmadığı, ancak von Willebrand faktörü olarak bilinen faktör VIII kompleksinin bir kısmını değiştirdiği için alışılmadık bir agonisttir.
Modifiye edildiğinde, bu protein küresel bir yapıdan doğrusal bir yapıya dönüşür. Doğrusal yapı daha sonra birkaç trombosite bağlanır ve psödoagregasyon verir. Von Willebrand proteininde nicel ve nitel değişiklikler olan hastalarda ristocetine anormal bir yanıt görülür.
Trombosit Fonksiyon Analizörü PFA-100
PFA 100 cihazı (Dade), kolajen/epinefrinin neden olduğu kapanma süresini ölçmek için rutin laboratuvarlarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. Cihaz, kesme gerilimi altında kolajen kaplı bir kapiler üzerinde trombosit tıkacı oluşumunu ölçer. Sitratlı venöz kan, epinefrinle kaplı bir zarla temas etmek için bir kılcal borudan çekilir ve trombosit aktivasyonu ile sonuçlanır.
Kan daha sonra zardaki hassas bir açıklıktan aspire edilirken trombositler açıklığı kapatmak için sabit bir tıkaç oluşana kadar çevreye yapışmaya başlar. Bu nedenle kapanma süresi, kanın açıklıktan geçmesini durdurmak için geçen süredir ve ex vivo trombosit tıkacı oluşumunun bir ölçüsüdür. Bu metodoloji artık birçok laboratuvar için trombosit araştırmalarının ilk aşamasını temsil etmektedir.
Trombosit Salınımına Yönelik Araştırmalar
Trombosit salınımını inceleyen teknikler, radyoizotop kullananlar ve lusiferinaz enzimini kullanarak ışık üretimini kullananlar olarak ikiye ayrılabilir. İzo-konu teknikleri iki şekilde gerçekleştirilebilir.
Trombositler, 5-HT salınımını aramak için 14C etiketli 5-hidroksitriptamin (5-HT) gibi araştırılan moleküle dahil edilebilecek bir radyoizotop ile inkübe edilebilir. Bu yöntemlerde, trombosit açısından zengin plazma, ilgili bir radyoaktif bileşik ile bir süre inkübe edilir.
Trombositler daha sonra plazmadan ayrılır ve fazla radyoizotop uzaklaştırılır. Bunu yapmak için trombositler bir albümin yoğunluk gradyanından geçirilerek trombosit peletini altta, radyoaktif plazma üstte kalacak şekilde döndürülür. Trombosit peleti daha sonra bir tampon içinde yeniden süspanse edilir, tekrar yıkanır ve sayılır.
Güçlü bir agonistle trombosit agregasyonundan sonra, trombositten fakir plazma da sayılır ve trombositten fakir plazmadaki radyoaktivite miktarı, tam trombosit numunesindeki aktivitenin yüzdesi olarak ifade edilir.
Radyoizotopları kullanan ikinci bir teknik, bir radyoimmün tahlili (RIA) gerçekleştirmektir. Bu metodoloji ile incelenen bileşik, aynı bileşiğin bir radyoaktif izleyici ile etiketlenmiş bir kısmı ile karıştırılır. Bu karışıma, araştırılan bileşiğe özel bir and antikor eklenir.
Flow sitometri normal değerler
Flow sitometri cihazı
Flow sitometri cihazı Nedir
Flow sitometri fiyat
Flow sitometri cihaz fiyatları
Flow sitometri kullanım alanları
Flow sitometri Laboratuvarı
Flow sitometri yorumlama
İnkübasyondan sonra, antikora bağlı bileşik bağlanmamış olandan genellikle aktif kömür ilavesi ve ardından santrifüjleme ile ayrılır. Peletteki veya serbest süpernatandaki radyoaktiviteyi saymak mümkündür.
Antikor, radyoetiketli ve radyoetiketlenmemiş numuneleri eşit miktarda bağladığından, antikor tarafından bağlanan radyoaktivite oranı, araştırılan plazmadaki bileşik miktarı ile ters orantılıdır. Yöntem, bir grafik oluşturmak için bilinen kontrol plazma konsantrasyonları kullanılarak nicelendirilir ve ardından numuneler için okumalar grafikten ölçülür.
Kemilüminesans, trombosit salınım reaksiyonunun araştırılmasında kullanılan başka bir tekniktir. Bu, ATP ve lusiferinazın ışık fotonları üretmek için lusiferin üzerinde reaksiyona girdiği ateş böceğinde gerçekleşen aynı kimyasal reaksiyona dayanmaktadır. Reaksiyon, üretilen ATP miktarına bağlıdır.
Trombosit reaksiyonunda, trombosit salma bileşikleri ile birlikte bir reaksiyon şişesine lusiferinaz ve lusiferin eklenir. Reaksiyon şişesindeki ATP miktarı üretilen ışık miktarını belirler. Daha yüksek bir ışık üretimi, trombositlerden daha yüksek bir ATP salınımından kaynaklanır.
Akış Sitometrisi
Akış sitometrisi, trombositlerde eksprese edilen spesifik antijenlere karşı trombosit fonksiyonunu araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Akış sitometrisinin metodolojisi Bölüm 32'de tartışılmaktadır. Trombosit araştırmaları için tanımlanabilecek iki ana protein vardır; trombositin hücre duvarına bağlanması için gerekli olanlar ve trombositlerin birbirine agregasyonu için gerekli olanlar yer alır.
Glikoprotein Ib, trombositlerin von Willebrand faktörü aracılığıyla subendotelyal matrikse bağlanması için gerekli olan bir yüzey antijenidir. Glikoprotein IIb/IIIa, trombosit agregasyon reaksiyonu için gerekli olan ana bileşenlerden biridir. Bu nedenle trombosit fonksiyonundaki bir eksiklik, bu proteinlerden herhangi birine karşı oluşturulan monoklonal antikorlar kullanılarak tanımlanabilir.
Trombosit membrana bağlı glikoproteinlerdeki anormallikleri araştırmak için yavaş santrifüjleme ile trombositten zengin bir plazma hazırlanır. Plazma daha sonra trombositten fakir plazma veya albümin içinde seyreltilerek yaklaşık 1 109=1 trombosit sayısı elde edilir.
Bunun bir alikosu daha sonra glikoproteine özgü floresan etiketli bir monoklonal antikor ile karıştırılır. İnkübasyondan sonra, tüm miktar tekrar yaklaşık 0.5 ml verecek şekilde seyreltilir. Numune daha sonra bir akış sitometresi ile analiz edilir. Pozitiflik için, floresan indeksi, aynı hastanın trombositlerinin florokrom içermeyen bir kontrol örneğinden daha yüksek olmalıdır.
Trombositler, kanın en küçük hücresel bileşenidir ve inceleme altındaki trombositlerin etrafından geçiş yapmak basit olduğundan, kırmızı hücreleri parçalamak veya numuneden herhangi bir kalıntıyı çıkarmak gerekli değildir.
Trombotik bozukluklarda trombositlerin rolüne artan bir ilgi vardır. Bu, trombotik epizodlar sırasında aktive olan trombosit popülasyonlarını belirlemek için trombositlerin araştırılmasına yol açmıştır, örn. protez kalp kapağı değişimlerinden sonra. Aktivasyonun iki ana belirteci tanımlanmıştır.
Biri, özellikle IIb/IIIa olmak üzere membran glikoproteinlerinin konformasyonel şeklindeki değişikliklerden kaynaklanmaktadır. Bu değişiklik, dinlenme trombositinde moleküller üzerindeki bobinler içinde gizlenmiş olan bölgeleri dış ortama maruz bırakır. Bu aktivasyon epitoplarına karşı birçok antikor üretilmiştir.
Bu aktivasyon antijenleri sadece zayıf trombin solüsyonları ile aktive edilmiş trombositlerde gösterilebilir ve tedavi edilmemiş trombositlerde negatiftir. İkinci tip bir aktivasyon proteini, granüllerin parçaları trombositlerin yüzey membranında eksprese edildiğinde tanımlanır.
Bu, granüller salgılama sürecinden geçtiğinde ve granüllerin zarı trombosit dış zarına dahil olduğunda gerçekleşir. Bunlara trombosit aktivasyon kaynaklı granüler dış membran (PAD-GEM) adı verilmiştir.
Bu belirteçlere karşı antikorları tek başına veya kombinasyon halinde kullanarak ve yukarıda açıklanan teknikle bir akış sitometresi kullanarak aktive trombositlerin oranını belirlemek mümkündür.
Sorpsiyon Modeli – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Deplasman Modeli NPC'nin tutma mekanizmasına yönelik deneysel araştırmaların çoğu, sabit faz olarak silika kullanılarak gerçekleştirilmiştir, ancak son zamanlarda bu çalışmalar diğer polar bağlı destekleri (amino fazı) içerecek şekilde genişletilmiştir. Farklı…
