Moleküllerin durağan faz ile hareketli faz arasındaki göçü, tüm kromatografi formlarında yüksek çözünürlük için zararlı olan bir faktör olan rastgele hareket veya difüzyon tarafından yönlendirilir. SEC’deki çözünürlük yalnızca difüzyona bağlı olduğundan, diğer kromatografi formlarından farklı olarak, sabit faz partiküllerinin optimizasyonu kütle transferini iyileştirmek için önemlidir.
Kütle transferine zararlı faktörler üç ayrı türe ayrılabilir: partiküllerin gözeneklerindeki durgun hareketli faza atfedilenler, çözünen moleküllerin sabit faza farklı penetrasyonundan kaynaklananlar ve son olarak partiküller arasında uzunlamasına difüzyon vardır.
Mevcut en iyi destekler olsa bile, parçacık şekillerinde moleküllerin nüfuz edeceği tek tip olmayan kanallara yol açacak bazı düzensizlikler olacaktır. Kolonun fiziksel parametrelerinin optimizasyonu, sabit faz tipi ve paketleme yöntemi normalde bu etkilerin üstesinden gelmeye yöneliktir.
Mobil Faz Efektleri
p H
Mobil faz, hem durağan faz hem de çözünen madde ile doğrudan etkileşim yoluyla çözünürlüğü etkileyebilir. Silika kolonlar, daha sonra zayıf katyon değiştiriciler olarak katılabilecek silanolat anyonlarının oluşumunu en aza indirmek için 7.0’dan düşük pH değerlerinde en iyi şekilde kullanılır. Silika bazlı sabit fazların silanizasyonu, sulu mobil fazların veya numune moleküllerinin serbest silanolat anyonları ile herhangi bir etkileşimini önlemek için gereklidir.
Kovalent bağ
Kovalent bağ örnekleri
Kovalent bağ Özellikleri
Kovalent bağ nedir
Kimyasal aktivite nedir
İyonik bağ nedir
İyonik bağ kuvveti
İyonik güç hesaplama
İyonik Güç
Makromoleküllerin SEC’si genellikle yüklü kalıntıları stabilize etmek ve böylece çözünen maddenin yapısal bütünlüğünü korumak için karşı iyonlar içeren tamponlar kullanılarak gerçekleştirilir.
Bu, çok çeşitli etkileşimli gruplar içeren proteinler için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, aşırı derecede yüksek bir iyonik kuvvet, hidrofobik etkileşimleri teşvik etme eğiliminde olacaktır ve bu nedenle, normalde düşük iyonik kuvvetli bir tampon (0.1 M) tavsiye edilir. Uygun karşı iyonların (Na +, K ‘, NH 🙂 dahil edilmesi, reaktif silanolat anyonlarını maskeleyerek yüksek pH değerleriyle ilişkili bazı problemleri de ortadan kaldıracaktır.
Düşük iyonik güç koşullarında pH’ı değiştirerek, durağan fazın polaritesi, çözünen maddenin belirli gereksinimlerine uyacak şekilde değiştirilebilir. Bu, ‘ideal olmayan’ SEC olarak adlandırılmıştır ve belirli proteinler için kullanışlıdır.
Akış Hızı
Çeşitli makromoleküllerin bir dizi sabit fazda çözünürlüğü için yaklaşık 0,5-1,0 ml / dakika mobil faz akış hızları önerilir. Bununla birlikte, TSK SW ve H tipleri ile kullanım için 0.1-0.5 ml / dk’lık akış hızları tavsiye edilmektedir. Genel olarak, daha büyük moleküller (polinükleotidler, proteinler) için, kütle transfer terimi çok daha büyüktür ve akış hızının, çözünürlüğü korumak için buna uygun şekilde azaltılması gerekir.
Moleküler Ağırlık Tayini
Çözünen moleküllerin boyutu, belirli bir çözücü içindeki hidrodinamik yarıçapları (Stokes yarıçapı) ile karakterize edilir. SEC kullanılarak, bilinmeyen bir protein veya polimerin moleküler ağırlığını, bir dizi bilinen moleküler ağırlık standardı için alıkoyma hacminin bir alıkoyma hacmi grafiği ile moleküler ağırlığın logaritması ile karşılaştırarak tahmin etmek mümkündür.
Bu grafikler, bilinmeyenlerin çözümde standardınkine benzer bir konformasyonu benimsemeleri koşuluyla, polimerler ve proteinler için doğru moleküler ağırlık belirlemeleri sağlayabilir. Bu, doğal bir hata anlamına gelir ve yalnızca bu tür bir analize dayalı hesaplamalar daha fazla onay gerektirir.
Daha doğru bir değerlendirme için,% 0.1 sodyum dodesilsülfat (SDS) veya 6 M guanidin hidroklorür gibi güçlü denatüranlar, sulu SEC’de mobil faza dahil edilebilir. Bu, çözünen maddenin bileşenlerinin tek tip konformasyonunu teşvik etme eğilimindedir ve ideal duruma daha yakın olacaktır. Denatüranların dahil edilmesi, sabit fazda çözünen maddelerin herhangi bir kimyasal etkileşimini azaltma ek faydasına sahiptir.
Deterjanın mobil faza eklenmesi rastgele bobin yapısını destekler ve bu nedenle Stokes yarıçapında karşılık gelen bir artış meydana gelir.
Bu, multimerik enzimlerin bazı alt birimleri bu koşullar altında ayrışacak olmasına rağmen, hem lifli hem de küresel proteinlerin moleküler ağırlıklarının tahmini için yararlı olmuştur.
Moleküler ağırlığın belirlenmesi için SDS ve SDS-poliakrilamid jellerde SEC’in bir karşılaştırması, çözünen maddenin ayrıntılı bir bilgisi mevcut olduğunda ilkinin daha yararlı olduğu sonucuna varmıştır. Alternatif olarak, yük etkileşimleri, kimyasal modifikasyonla tamamen nötralize edilebilir ve hidrofobik etkileşimleri de bozarak, çözünen ideal şekilde davranmalıdır.
Yüksek performans SEC için ilk destekler, kararlılık, çözünürlük ve kurtarma açısından hayal kırıklığı yarattı. Son gelişmeler bu sorunların çoğunu telafi etti ve araştırmacılara başka bir güçlü fraksiyonlama aracı sundu.
Geri kazanım genellikle% 90’ın üzerinde olduğundan, mobil faz basit olduğundan (karmaşık tampon değişikliği veya gradyan gerektirmediğinden), profil yüksek oranda yeniden üretilebilir olduğundan ve elüsyon sırası tahmin edilebilir olduğundan, diğer kromatografi formlarına göre belirgin avantajlar vardır.
Yüksek performanslı normal faz kromatografisi
Normal faz kromatografisi terimi, sıvı-katı faz kromatografisinin iki alt sınıfından birini tanımlar, bunlar normal faz (NPC) ve ters faz (RPC) kromatografisidir. Normal faz kromatografisi, esas itibarıyla polar olmayan ters faz desteklerinin aksine, fizikokimyasal terimlerle nispeten polar olan sabit fazlarda gerçekleştirilir.
Bu nedenle NPC, tutulması sabit faz ile mobil faz arasındaki polar etkileşimler tarafından yönetilen bir polar sabit faz üzerindeki bir çözünen maddenin kromatografisi olarak düşünülebilir.
Solüt ve çözücü molekülleri arasında meydana gelebilecek karmaşık etkileşimler nedeniyle, aşırı durumlar haricinde genelleştirilmiş bir tutma teorisini sunmak zordur.
Dağılım kuvvetleri, dipol momentleri, hidrojen bağı ve iyonlar arasındaki dielektrik etkileşimlerden bu etkileşimlere katkılar da meydana gelebilir. Şu anda, NPC’deki tutma mekanizmasını açıklamak için iki önemli teorik model önerilmiştir; bunlar yer değiştirme modeli ve sorpsiyon modeli olarak da bilinir.
İki modelin ayrıntılı bir karşılaştırması için okuyucu başka bir yerde belirtilmiştir. Bu bölümde modellerin her birine sadece kısa bir genel bakış da tartışılacaktır.