Çözünürlüğü Etkileyen Faktörler – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Boyut dışlama terimi, bu metinde, aksi takdirde jel filtrasyonu ve jel nüfuzu olarak bilinen kromatografi formlarını kapsamak için kullanılmaktadır. Özellikle proteinler için yüksek performans (daha hızlı analiz, daha iyi çözünürlük anlamına gelir) boyut dışlama desteklerinin geliştirilmesi, esas olarak ayrılmanın dayandığı ilkenin doğasında bulunan zorluklar nedeniyle nispeten yavaş olmuştur.
Prensipler
Belirli bir gözenek boyutuna sahip gözenekli malzeme ile paketlenmiş bir kolona farklı boyutlarda bir molekül karışımı uygulanırsa, moleküllerin yalnızca belirli bir yüzdesi gözeneklere girecek kadar küçük olacak, geri kalanı hariç tutulacaktır. Bu nedenle daha büyük moleküller gözeneklerde daha az zaman harcarlar ve kolondan daha hızlı geçerler.
Ayırma, moleküllerin kimyasal özelliklerine değil fiziksel parametrelerine dayanmaktadır ve SEC’i diğer kromatografi formlarından ayıran bu ilkedir. İki bileşiğin ayrılması, moleküllerin hareketli faz ile durağan faz arasındaki dağılımındaki farklılıklar nedeniyle oluşur.
Boyut dışlama kromatografisi teorisinin matematiksel işlemleri genellikle çözünen molekülleri küresel olarak ve sabit fazı sert bir jel olarak kabul eden modellere dayanır, ancak gerçekte tüm moleküller çözelti içinde aynı şekle sahip değildir. Belirli bir moleküler ağırlığa sahip bir polimerin, çok daha yüksek moleküler ağırlıklı bir küresel proteininkine eşdeğer bir yarıçapa sahip olabileceği gösterilmiştir.
SEC’in teorik analizi, kromatografik elüsyon profilinden türetilebilir. Belirli bir molekülün tutulması, dağıtım katsayısı Kd olarak ifade edilir; burada V, sabit fazın partiküllerinin dışındaki çözücünün hacmidir ve V, kromatografi için mevcut olan partiküllerin içindeki çözücüdür.
LKB teknik broşüründen izin alınarak çoğaltılmıştır. İlgili belirli bir molekülün elüsyon hacminin (V,) belirlenmesine izin verir. Çözünen büyükse ve jelden dışlanmışsa, V, = V ve K, = 0. Eğer çözünen, erişilebilen gözenek hacminin tamamına tamamen nüfuz edecek kadar küçükse, o zaman V, = V, + ve Kd = 1 olur.
Pratikte Kd’nin değeri 0 ile 1 arasında değişir çünkü gözenek hacminin tamamı tamamen erişilebilir değildir. Herhangi bir sütun için, bu parametreler ve elüsyon hacmi arasında sabit bir ilişki olacaktır; ancak, Kd’nin değeri sütun parametrelerinden (yani yükseklik, çap) bağımsızdır.
Su eklemek çözünürlüğü değiştirir mi
Çözünme hızını etkileyen Faktörler
Gazların çözünürlüğü neye bağlıdır
Çözünürlüğe Etki Eden Faktörler Ortak iyon etkisi
Çözünürlüğe Etki Eden Faktörler nelerdir
Gazların çözünürlüğü sıcaklık arttıkça neden azalır
Gazların çözünürlüğüne sıcaklığın Etkisi
Sudaki çözünürlük sıralaması
Çözünürlüğü Etkileyen Faktörler
Seçicilik
SEC ilkesi diğer kromatografi biçimlerinden farklı olduğundan, çözünürlük denkleminin parametreleri normalde uygulanamaz. Bununla birlikte, SEC’deki seçiciliğin kontrolü, durağan fazın parametreleri optimize edildiğinde basit ve tahmin edilebilirdir.
Durağan fazın kritik özellikleri, gözenek hacmi, gözenek boyutu dağılımı ve parçacık şeklidir. Desteğin, numune molekülleri ve mobil faz ile hem iyonik hem de hidrofobik etkileşimlere inert olması da önemlidir.
Partikül şeklini ve boyut dağılımını optimize etmeye yönelik gelişmeler, küresel şekilli ve artı veya eksi% 10’luk minimum boyut dağılımı ile küçük partiküllerin (5-100 um) giderek daha popüler kullanımına yol açmıştır.
Bu kriterlerin sıkı kontrolü, kolon verimliliğinin fiziksel yönlerinin manipülasyonu için gereklidir. Gözenek boyutu dağılımındaki fazlalık tepe genişlemesinin artmasına neden olur. Mekanik stabiliteye sahip olmayan yumuşak dekstranlar ve agarozlar, uygulanan basınçlar nedeniyle HPLC’de kullanıma uygun değildir.
Halihazırda kullanılmakta olan ticari olarak temin edilebilen desteklerin bir listesi literatürde bulunabilir. Sulu SEC için en yaygın iki sabit faz, çapraz bağlı polimer bazlı polieter veya polyester ve silika bazlı fazlardır.
Bu sabit fazların her biri, yüzeye kovalent olarak bağlı hidroksil gruplarına sahiptir. Sulu olmayan SEC için silika bazlı fazlar popülerdir, örn. ZORBAX SEC, “silanize” gözenekli silika mikro küre. Alternatif olarak, polistiren divinil benzen sabit fazlar kullanılmıştır ve artık çok çeşitli verimlilik ve gözenek boyutlarında mevcuttur, örn. TSK H.
Şu anda en popüler iki sabit faz, bir organik fazın eklendiği silika bazlı, yani gliserol-propil tipi, Waters 1 serisi, Synchropak GPC, TSK SW tipleri. Bu sabit fazlar, sulu tamponlarla kullanıma uygun özelliklere sahiptir.
Sulu olmayan tamponlarla kullanım için en popüler sabit fazlar, sulu çözücülerle de kullanılabilen PSDV (Spheron, Shodex) ve metakrilat (Spheron P serisi) türleridir. TSK PW polieter destekleri, proteinlerin ve polinükleotitlerin çok popüler f9r ayrımıdır.
25-4000 A gözenek boyutları mevcuttur. Bundan daha büyük gözenek boyutları, azalan plaka sayısı nedeniyle azalmış çözünürlük gösterme eğilimindedir.
Sütun Kapasitesi
SEC’in diğer kromatografi formlarına kıyasla dezavantajı, nispeten düşük numune kapasitesidir. Optimum çözünürlüğün gerekli olduğu analitik ayırmalarda, toplam yük hacmi toplam kolon hacminin 1-248’ini geçmemelidir. Tamponları değiştirmek veya bir numuneyi tuzdan arındırmak amacıyla SEC kullanıldığında, kolon hacminin% 10’una kadar kolayca barındırılabildiğinden, bu her koşulda geçerli değildir.
Gözenek Boyutu Dağılımı
SEC’de seçiciliği etkileyen kritik bir özellik, gözenek boyutu dağılımının en aza indirilmesidir. Bu parametrenin kontrolü, belirli bir boyut dağılımına sahip moleküllerin ayrılmasını kolaylaştırır. Sabit fazlar çok çeşitli gözenek boyutlarında mevcuttur ve genellikle bu sütunlar seri olarak kullanılabilir. Böylelikle, geniş bir aralık içinde etkili seçim, birinci sütun tarafından gerçekleştirilir ve daha tanımlanmış bir aralık içinde bölünme, ikinci sütunda elde edilir.
Gözenek Seviyesi
Gözenek hacmi (V,) SEC’de çözünürlüğü etkileyen önemli bir parametredir. Bu parametre, büyük bir gözenek hacmi genellikle yüksek akış hızlarında artan basınçlara mekanik olarak daha az kararlı olacak açık kafes boncuk yapısı kullanılarak elde edildiğinden, sabit fazların tasarımında zorluklar ortaya çıkarır.
Gözenek hacmi ve mekanik stabilite arasındaki uzlaşma, makromoleküller için uygun desteklerin geliştirilmesinde en büyük zorluk olmuştur. Bu nedenle, analitik boyut dışlama kolonları genellikle diğer kromatografik modlarda kullanılanlardan daha uzundur, böylece sabit faz miktarı ve dolayısıyla kromatografi için mevcut olan etkili gözenek hacmi artar.
Çözünme hızını etkileyen Faktörler Çözünürlüğe Etki Eden Faktörler nelerdir Çözünürlüğe Etki Eden Faktörler Ortak iyon etkisi Gazların çözünürlüğü neye bağlıdır Gazların çözünürlüğü sıcaklık arttıkça neden azalır Gazların çözünürlüğüne sıcaklığın Etkisi Su eklemek çözünürlüğü değiştirir mi Sudaki çözünürlük sıralaması