TaqMan tahlili, sırasıyla Thermus aquaticus ve Thermus thermophilus'tan izole edilen Taq veya Tth polimerazı kullanır, ancak 50 nükleaz aktivitesine sahip herhangi bir enzim kullanılabilir. Amplifikasyon sırasında, uzatılamayan prob, Taq veya Tth DNA polimerazın 50 eksonükleaz aktivitesi ile bölünür, böylece haberciyi oligonükleotid söndürücüden serbest bırakır ve haberci emisyon floresan yoğunluğunda bir artış üretir.
Bu, 7700 Sekans Dedektör Sistemi kullanılarak PCR amplifikasyonunun üstel aşaması sırasında gerçek zamanlı olarak izlenir. Bölünme, probu hedef iplikten çıkararak primer uzantısının şablon ipliğin sonuna kadar devam etmesine izin verir.
Sürece genel bir bakış Şekil 51.2'de gösterilmektedir. Ek raportör boya molekülleri, her döngüde ilgili problarından ayrılarak, üretilen amplikon miktarıyla orantılı olarak floresan yoğunluğunda bir artışa yol açar.
Taq polimerazın eksonükleaz aktivitesi, aktivite çift sarmal spesifik olduğundan, yalnızca florojenik prob hedefe tavlanırsa etki eder, bu nedenle enzim, solüsyonda serbest olduğunda ve raportör floresan tespit edilmediğinde probu hidrolize edemez. .
Polimeraz, yalnızca tamamlayıcı ipliğine hibridize kalırken probu böldüğünden, prob bağlanmasını sağlamak için PCR uzantısının sıcaklık koşulları ayarlanmalıdır. TaqMan sistemi, amplifikasyon sırasında probun hibridize kalmasını sağlamak için 60-62 C'de birleşik bir tavlama ve polimerizasyon adımı kullanır.
Çoğu probun erime sıcaklığı (TM) yaklaşık 10 C veya PCR primerlerinden en az 5 C daha yüksektir, çünkü TaqMan probunun primerlerden önce bağlanması çok önemlidir. sürecin başarısı.
Onsuz, PCR ürünleri floresan oluşturmadan ve dolayısıyla algılama olmadan oluşturulacaktır. Bu, primer uzatma adımı sırasında probun hedefine bağlı kalmasını sağlar ve ayrıca Taq ve Tth DNA polimerazlarının maksimum 50-30 eksonükleaz aktivitesini sağlar.
NOT: Bir raportör ve bir söndürücü dizisi ile etiketlenmiş bir dahili prob kullanılarak TaqMan PCR'nin şeması. TaqMan primerleri ve prob denatüre DNA'ya tavlama. Polimerizasyon sırasında prob yarılır ve söndürücü boyadan raportör boyayı serbest bırakır, bu da floresan sinyalde birikmiş olan PCR ürününün miktarıyla orantılı bir artışa neden olur.
Prob ucu fiyatları
Renishaw prob fiyatları
Prob ucu nedir
Renishaw prob kalibrasyon
Prob nedir
Prob Fiyatları
CMM prob ucu fiyatları
CNC Sifirlama prob fiyatları
Küçük Oluk Bağlayıcı TaqMan Probları
Daha yakın zamanlarda, TaqMan testinin hassasiyetini artıran minör oluk bağlayıcı (MGB) TaqMan florojenik probları geliştirilmiştir. MGB'ler (doğal olarak oluşan antibiyotikler ve sentetik moleküller), çift sarmallı DNA tarafından oluşturulan sarmalın küçük oluğuna sığabilir ve bir oligonükleotit probuna bağlandığında yanlış eşleşme ayrımını artırarak DNA duplekslerini stabilize edebilir.
TaqMan MGB florojenik probları, onları geleneksel florojenik problardan üstün kılan bir dizi özelliğe sahiptir. Bir MGB, oligonükleotidin 30-ucuna, 50-ucuna veya bir dahili nükleotitine eklenebilir.
MGB probları tamamlayıcılarına daha sıkı bağlanır, bu da probların erime sıcaklığını (Tm) yükseltir ve daha esnek test tasarımına izin verir. Çalışmalar, Tm'si 20 C olan 12 mer'lik bir prob üzerine bir MGB'nin eklenmesinin Tm'yi 65 C'ye çıkardığını göstermiştir.
Bu Tm, MGB'siz 27-mer probun Tm'sine eşdeğerdir. Tm probunun primer Tm'den >10 C daha yüksek olması tavsiye edilir, bu nedenle bir MGB'nin eklenmesi, daha geniş bir primer yelpazesinin kullanılmasına izin vererek test tasarımına önemli ölçüde katkıda bulunur.
Bir MGB'nin kullanılması, daha kısa probların kullanılmasına ve daha iyi uyumsuzluk ayrımı yapılmasına olanak tanır. MGB-oligonükleotitler, eşleşmenin Tm'si ile tek-bazlı uyumsuzluk oligonükleotitleri arasında artan bir fark gösterir, bu nedenle hibridizasyon deneylerinin ayırt edici gücünü arttırır.
MGB problarının diğer bir özelliği, düşük arka plan floresansı ve bunun sonucunda daha büyük bir sinyal:- gürültü oranıdır. Sağlam MGB problarının arka plan floresansı, prob uzunluğu ile biraz artar, ancak yine de MGB'siz problardan birkaç kat daha düşüktür. MGB probları, bir DNA dupleksinde A-T bağlarını G-C bağlarından daha fazla stabilize eder. Bu, hedef dizinin Tm üzerindeki etkisini azaltır.
Ayrıca, uyumsuzluk MGB'nin altına yerleştirildiğinde uyumsuzluk ayrımının iyileştiği de bulunmuştur. Tipik olarak, bir oligonükleotit-MGB konjugatı, MGB, yaklaşık 6-7 bazdan oluşan A-T açısından zengin bir bölge içeren bir oligonükleotidin 30 ucunda yer alacak şekilde tasarlanır.
MGB-bağlanma bölgesi içinde konumlanan uyumsuzlukların daha iyi ayırt edildiği ve MGB altındaki farklı uyumsuzluk çiftleri için uyum ve uyumsuzluklar arasında artan bir serbest enerji farkı gösterdiği gözlemlendi.
TaqMan Primer ve Prob Tasarımı
TaqMan PCR testinin özgüllüğü ve duyarlılığı, primer ve prob dizilerinin seçimi ile belirlenir. Applied Biosystems, optimal TaqMan PCR tahlillerini tasarlamak için kullanılabilen Primer Express olarak bilinen özel bir yazılım programı geliştirmiştir.
TaqMan PCR primerleri için optimal uzunluk, G/C içeriği %30-80 olan 15-20 bazdır, burada 30 uçtaki son beş nükleotit ikiden fazla G ve C kalıntısı içermez. Hem ileri hem de geri primerlerin Tm'si 58-60 C olmalıdır ve 1-2 C'den fazla farklılık göstermemelidir.
Daha kısa PCR amplikonları, daha uzun amplikonlardan daha verimli amplifiye olma eğilimindedir ve bu nedenle testin duyarlılığını arttırır. Genel olarak TaqMan PCR amplikonları için optimal uzunluk 50-150 bp'dir, ancak daha büyük amplikonlar başarıyla amplifiye edilmiştir.
TaqMan probları genellikle PCR primerlerinden en az 10 C daha yüksek bir Tm ile tasarlanır. Bu, probun primerlerden önce hibritleşmesini ve tavlama adımı sırasında hibridize kalmasını sağlar. TaqMan probları, %50 G/C içeriği ile 13-30 baz uzunluğunda olabilir.
TaqMan probları, primerlerden herhangi biri ile örtüşme veya tamamlayıcılık olmadan mümkün olduğunca yakın tasarlanmalıdır. Ek olarak, TaqMan probları 50 uçta bir G içermemelidir, çünkü raportör boyaya bitişik bir G, bölünmeden sonra bile floresanı söndürecektir. Yukarıda tartışıldığı gibi MGB TaqMan problarının kullanımı, gerekli Tm'yi korurken probun uzunluğunu büyük ölçüde azaltır.
İdeal olarak, herhangi bir özel tahlilde PCR'nin üstel ve plato fazının nerede meydana geldiğini değerlendirmek için primer ve prob optimizasyonu yapılmalıdır. Primerler genellikle 50–200 nM aralığında kullanılırken, prob genellikle 100 nM aralığındadır.
RNA gen hedefleri için, TaqMan RT PCR tahlilleri, kontamine edici genomik DNA'nın amplifikasyonundan kaynaklanan yanlış pozitif sonuçları en aza indirmek için ideal olarak intron-ekson sınırı boyunca tasarlanmalıdır. Ayrıca RNA/cDNA'nın Mn2+ varlığında amplifikasyonu, yeniden tavlanmış DNA fragmanlarının amplifikasyonundan kaynaklanabilecek sorunları en aza indirir.
Türevlendirme
Türevlendirme, kromatografiden önce veya sonra gerçekleştirilebilir.
Ön sütun türevlendirme
Ön kolon türevlendirmesinin avantajları, sadece örnek tespitinin geliştirilebilmesi değil, aynı zamanda bileşiklerin ekstraksiyonunun, saflaştırılmasının ve kromatografisinin modifiye edilebilmesidir. Ek olarak, çok çeşitli reaktifler mevcuttur.
Bununla birlikte, kolon öncesi türevlendirmenin dezavantajları, örneklerin türevlendirme prosedürü sırasında bozunması ve kimyasal reaksiyonların tamamlanmayarak kromatogramda sahte zirvelere yol açmasıdır.
Sütun sonrası türevlendirme
Ön kolon türevlendirmeden farklı olarak, kolon sonrası türevlendirme reaksiyonunun tamamlanmasına gerek yoktur, ancak reaksiyonun boyutu tekrarlanabilir olmalıdır. Reaktör tasarımının çok önemli bir faktör olmasına yol açan, bant yayılmasını sınırlandırma arzusuyla birleştiğinde bu gerekliliktir.
Üç reaktör tasarımı popülerdir, spesifik seçim reaksiyon hızına bağlıdır ve ideal olarak çok hızlı olmalıdır (<30 s). İlk tasarım, hem kolon eluent hem de reaktif ile basit bir T-bağlantı noktasıyla sağlanan basit bir bobinden oluşur ve 1 dakikadan daha kısa reaksiyonlar için idealdir.
5 dakikaya kadar küçük cam boncukların (<20 pm) paketlenmiş yataklarının reaksiyonları için kullanılır ve daha uzun reaksiyon süreleri için bant genişlemesini en aza indirmek için hava bölümlü akış sistemi gereklidir.
Tüm bu yöntemlerin numuneyi tahrip ettiği ve bu nedenle pik toplama gerekliyse bir tür eluent akışı bölme işleminin gerekli olduğu bilinmelidir. Sütun sonrası türetme yöntemlerinin bazı örnekleri bulunabilir.
HPLC
HPLC ve GC arasındaki Farklar
Türevlendirme nedir
HPLC dedektörleri
Gaz kromatografisi Dedektörleri
Hplc Nedir
DAD dedektör
HPLC ve GC karşılaştırma
Sütun yapımı
Çoğu HPLC kolonunda kullanılan 316 paslanmaz çelik dahil olmak üzere tüm metaller sonunda kimyasal korozyona uğrar ve özellikle halojenür iyonları HPLC sistemi kullanılmadığında tamamen çıkarılmalıdır. Tüm HPLC bileşenlerinin ya saf çözücüler içinde ya da organik çözücülerin sulu karışımları içinde depolanması iyi bir genel uygulamadır.
Düzensizlikler performans kaybına ve “kolondan kolona” zayıf tekrarlanabilirliğe neden olabileceğinden, tüm HPLC kolonlarının pürüzsüz bir iç yüzeye sahip olması çok önemli bir gerekliliktir.
En popüler kolon boyutları 150 mm X 4.6 mm I.D. tipik analitik uygulamalar için, hazırlayıcı ölçek ayırmaları için çok daha büyük kolon çapları mevcuttur. Daha yakın zamanlarda, analitik uygulamalar için daha küçük çaplı kolonlara büyük ilgi olmuştur, örn. mikro delik (0.5-1.0 rahibe kimliği); paketlenmiş kapiler (80-125 pm I.D.) ve açık tübüler kapiler (30-50 pm I.D.); bunlar Bölüm 10.9’da daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.
Frits
Bir HPLC mikro partikül kolonunun giriş friti genellikle 2 pm gözeneklidir ve mikropartikülat maddenin toplanması için en sık görülen noktadır, bu da sonunda artan geri basınçlara neden olur.
Fritler nispeten ucuz olduğu için en iyi çözüm eski friti yenisiyle değiştirmektir. Alternatif olarak, fritler ultra sonikasyon veya güçlü asitlerle işlem kullanılarak temizlenebilir.
Çoğu üretici, her bir ucunda aynı fritlere sahip kolonlar tedarik eder ve bu nedenle, genellikle tavsiye edilmemesine rağmen, kolon ters çevirme, üst fritin dışarı atıldığı bir yöntem olabilir. Bu yöntem, kolonun iyi paketlenmiş olması ve orijinal üst uçta hiç boşluk hacmi olmaması koşuluyla iyi çalışır.
HPLC’de mikro sütunlar
HPLC’deki en hızlı ilerleyen alanlardan biri, mikrokolon teknolojisidir ve çok uzak olmayan bir gelecekte yapılacak gelişmeler, muhtemelen mikrokolon HPLC teknolojisinin daha genel kullanıma sunulmasıyla sonuçlanacaktır.
Mikrokolon teknolojisindeki araştırmalar, 1960’ların sonlarında Horvath ve Lipsky (1966) tarafından 1 m uzunluğunda ve sadece 0,5 mm çapında olan ve pellicular materyalden oluşan bir pakete sahip kolonlar kullanılarak başlatıldı. Daha sonraki gelişmeler, bunların yerine 4-5 mm iç çapa ve 15-30 cm uzunluğa sahip kolonların geçmesi ile sonuçlanmıştır.
Mikro sütunların geleneksel sütunlara göre kendine özgü avantajlara sahip olduğu ve bir dizi farklı grup tarafından yapılan son çalışmalar, geniş olarak üç farklı kategoriye ayrılabilen mikro sütunların daha da geliştirilmesine yol açmıştır: mikro delikli (veya küçük delikli) paketlenmiş sütunlar, açık boru şekilli kılcal sütunlar ve paketlenmiş kılcal sütunlar.
Microbore paketlenmiş kolonlar
Bu kolonlar, yaklaşık 1 mm’lik bir iç çapa sahip olmaları dışında normal HPLC kolonlarına benzer. Paketleme malzemeleri, normal bulamaç paketleme teknikleriyle paslanmaz çelik kolonlara paketlenmiş küçük çaplı partiküllerden (3-30 pm) oluşur.
Silika jel sabit faz ile paketlenmiş 1 m’lik kolonlar kullanılarak iç çapın kolon verimliliği üzerindeki etkisinin incelenmesi, en düşük plaka yüksekliği değerlerinin (H) yaklaşık 1.02 mm’lik bir iç çap ile elde edildiğini göstermiştir.
Partikül boyutlarının etkisi de incelendi ve sonuçlar, 20 pm’lik bir paketlemenin optimum azaltılmış plaka yüksekliği eğrisini ürettiğini, ancak hem 5 pm hem de 10 pm paketlemelerin daha yüksek kolon verimleri verdiğini gösterdi. çap ve partikül boyutu, yalnızca ekipmanlarının belirli sabit fazı ve ekstra kolon ölü hacmi için geçerli olabilir.
Mikro delikli kolonların numune kapasitesinin, azaltılmış kesit alanlarından dolayı geleneksel kolonlara kıyasla çok daha düşük olduğu da not edilmelidir.
Açık boru şeklindeki kılcal kolonlar
Açık boru şeklindeki kapiler (OTC) kolonlar, gaz kromatografisinde kullanılan kapiler kolonların analoglarıdır ve genellikle çok düşük iç çaplara (50 pm veya daha az) sahip cam kolonlardan oluşur. sütun duvarına eşit olarak dağılmıştır.
Teorik olarak, OTC kolonlarının performansının geleneksel dolgulu kolonların performansına uyması için, iç çapın 10-30 aralığında olması gerekir.
OTC sütunlarından ayrıştırılan zirveler çok düşük hacimlidir ve bu, geleneksel detektörlerdeki (5-10 ul) akış hücrelerinin hacimleri elüe edilen tepe hacimlerinden çok daha büyük olduğu için teknik zorluklar yaratabilir.
Bu tür dedektörler OTC kolonları ile kullanıldığında bant dağılımı sonuçlanabilir ve bu şekilde bu kolonların içsel avantajlarını geçersiz kılar. Bu nedenle, akış hücresi hacmi 0.01-1 pl aralığında olmalıdır.
Benzer şekilde, kılcal sistemlerde hem minimum ölü hacim hem de enjeksiyon hacminde özel ön konsantrasyon ve numune alma tekniklerinin geliştirilmesini gerektiren bir azalma için bir gereklilik vardır.
OTC kolonlarının diğer bir kısıtlaması, numunenin aşırı yüklenmesine neden olabilecek küçük iç çaplarıdır; sadece 10 ng’den az miktarlar kullanılmalıdır.