“Bağlantı Molekülleri”
Dolaylı da olsa antijeni görselleştirmek için, hücreler veya dokulardaki bağlanma bölgesini lokalize etmek için görsel bir sinyal üretmek gerekir. Buna göre, yıllar içinde bir dizi “muhabir” sistemi geliştirilmiştir. Bunlar aşağı yukarı kronolojik olarak aşağıda açıklanmıştır.
Floresan Moleküller
Orijinal raportör, uygun antikora etiketlenmiş floresan boya, flüoresindir. Antijen daha sonra floresan mikroskobu ile görselleştirilebilir.
Floresan raportör molekülleri kullanmanın bir sınırlaması foto kararsızlığıdır, sinyal gün ışığına maruz kaldığında yavaş yavaş kaybolur. Floreseinin floresan yerine antijenik özelliklerinin artık IHC için biyotin bazlı olmayan tespit sistemlerinde iyi bir etki için kullanıldığına dikkat edilmelidir.
Artık, aynı doku içinde birden çok antijenin eşzamanlı olarak etiketlenmesine izin vermek için kullanılabilen, farklı uyarma ve emisyon frekanslarına sahip birden çok florofor bulunmaktadır.
İmmünofloresans günümüzde tanı laboratuvarında nispeten sınırlı bir kullanıma sahiptir, ancak yine de böbrek ve deri biyopsilerinin değerlendirilmesinde görülmektedir, çünkü belki de materyal kendini lineer veya membranöz antijen göstermeye borçludur.
Araştırmada antijen lokalizasyonu için hala yaygın olarak kullanılmaktadır ve aynı doku / hücre içinde aynı anda birden fazla antijeni lokalize etme yeteneği ile hücresel ve protein etkileşimleri hakkında yararlı bilgiler sağlar.
Peroksidaz enzimi ne ise yarar
Peroksidaz enzimi Özellikleri
Peroksidaz Nedir
Peroksidaz ne işe yarar
Peroksidaz görevi
Peroksidaz Testi
Peroksidaz aktivitesi
Peroksidaz enzimi nerede bulunur
Peroksidaz
Yaban turpu peroksidazı (HRP), insan hastalıklarının araştırılması için olağanüstü derecede uygun bir moleküldür. Birincisi, memeli kökenli değildir, tabii ki bir bitkiden türetilmiştir.
Bu, antijenik çapraz reaksiyon şansının azaldığı anlamına gelir; ancak, HRP’nin enzimatik aktivitesinin memelilerdekine benzer olduğu ve enzim dokularda veya hücrelerde gösterildiğinde sorunlara neden olabileceği unutulmamalıdır.
İkincisi, mikroskobik olarak görselleştirilebilen renkli bir reaksiyon ürünü üreten çeşitli substratlar ile reaksiyonu yoluyla kolayca gösterilebilir, örn. hidrojen peroksit varlığında 3,30-diaminobenzidin (DAB) vardır.
Son olarak, ultrastrüktürel seviyede kullanılabilen bir moleküldür. HRP etiketlemesi doğrudan, dolaylı ve çok aşamalı tekniklerde kullanılmıştır. Birkaç yıldır histopatoloji laboratuvarlarının temel dayanağı peroksidaz-antiperoksidaz (PAP) yöntemiydi. Bununla birlikte, bu muhtemelen genel olarak daha ‘güçlendirici’ avidin-biotin (ABC) tekniğiyle aşılmıştır.
HRP kullanımıyla ilgili bir problem, insan ve diğer dokulara endojen olan peroksidatik aktivitenin varlığında yatmaktadır ve bu, pozitif bir reaksiyona, örn. nötrofil polimorfları, endojen peroksidaz aktivitesine sahiptir.
Neyse ki, bu aktivite, bölümün bloke edici reaktiflerle, özellikle de metanol ve sodyum azit içindeki hidrojen peroksit veya hidroklorik asitle ön işleme tabi tutulmasıyla büyük ölçüde “bloke edilebilir”. Bu yapıldığında bile, peroksidaz açısından çok zengin olan nötrofil polimorfları ve mast hücreleri başta olmak üzere bazı hücreler yine de yanlış pozitif sonuçlar verebilir.
Alkalin Fosfataz
Alkalin fosfataz (AP), IHC’de, özellikle hücre hazırlıklarında yaygın olarak kullanılan bir başka enzimdir. Bu sonuncusu büyük ölçüde sonuçta ortaya çıkan alkalin fosfataz-anti-alkalin fosfataz (APAAP) etkileşiminin yüksek duyarlılığından kaynaklanmaktadır.
AP, belirli substratlarla canlı renk reaksiyonu ürünleri verebilir, ancak genel olarak bunlar, DAB reaksiyon ürününün aksine, çözünür olmaları sorunundan muzdariptir. Bu, bölümlerin sulu ortama monte edilmesi gerektiği anlamına gelir; bunlar daha önce sıvı kaldı ve uzun süreli depolamayla ilgili sorunlar yarattı, ancak kalıcı montaj malzemeleri artık mevcut.
Yine, endojen doku alkalen fosfataz ile ilgili sorunlar olabilir, ancak bu, levamizol gibi ajanlarla bloke edilebilir.
Altın Gümüş
Antikorlar, altın elementinin ince, muntazam kümelerine bağlanabilir ve bu da, farklı seçicilik sayesinde argento bileşiklerden gümüş ile reaksiyona girecektir. Bu, 10 yıl kadar önce, çalışmalarda hücre yüzeylerindekiler gibi düşük ekspresyonlu epitoplar için bir etiketleme yöntemi olarak kullanıldığında, hafif mikro-kapsam düzeyinde yaygın kullanım bulan çok hassas bir reaksiyon dizisi verir.
Bununla birlikte, yöntemin hiçbir zaman yaygın tanısal uygulama bulamadığı ve genellikle bir araştırma aracı olarak kaldığı belirtilmelidir. Ayrıca, büyük ölçüde avidin-biyotin kompleksi (ABC) yöntemleri serisiyle değiştirilmiştir.
Bununla birlikte, immünogold tekniğinin büyük bir kullanımı, immüno-elektron mikroskobu alanında yatmaktadır, burada metalik partiküllerin antijenik bölgelerde lokalize olduğu görülebilmektedir; aslında, farklı boyutlardaki altın partiküllerine bağlı antikorlar kullanılarak aynı preparatta birden fazla antijenin gösterilmesi mümkündür.
Avidin – Biotin
Avidin-biyotin yöntemleri, avidin (veya streptavidin) ile biyotin arasındaki yüksek afiniteli bağlanmaya dayanır. Bu son derece yüksek afinite, amplifikasyon, ABC gibi yüksek duyarlılıklı yöntemlerde bir ara aşama olarak uygulamalarının merkezinde yer alır.
İkincil antikorlar, HRP veya AP gibi bir raportör moleküle konjüge edilmiş üçüncül avidin tabakası ile biyotinile edilir. ABC yöntemi hem teşhis hem de araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanım bulmuştur ve muhtemelen şu anda standarttır.
ABC tabanlı sistemlerle ilgili olası bir sorun, hem avidin hem de biyotinin bazı normal dokularda bulunabilmesidir. Bu dokularla çalışırken bunu göz önünde bulundurmak önemlidir ve bu sorunu gidermek için avidin / biotin bloklarının kullanılması kullanılabilir.
Tiramin Sinyal Amplifikasyonu (TSA)
TSA, diğer yöntemlerden 103 kata kadar daha fazla çarpıcı sinyal amplifikasyonuyla sonuçlanan çok hassas bir yöntemdir. Bu sistemde HRP, hem doğrudan hem de dolaylı reaksiyonlarda bir florokrom veya biyotine bağlanan tiramit birikiminde bir katalizör görevi görür. Hedef antijen düşük seviyelerde ifade edildiğinde bu çok değerlidir ve standart IHC yöntemleri kullanılarak tespit için eşiğin altında olabilir.
Biyotin içermeyen sistemler
Normal doku içinde endojen enzim aktivitesi ve endojen moleküller ile ilgili sorunlar olabileceği daha önce belirtilmişti. Normal dokuda genellikle bulunmayan etiketler kullanılarak daha yeni yöntemler geliştirilmiştir.
Floresan, son zamanlarda, flüoresansı nedeniyle değil, bir antijen olarak bir bağlanma reaktifi olarak tercih edildi: Bu molekül, açıkça bir insan analoğuna sahip olmadığı için bariz bir avantaja sahiptir. Sinyal amplifikasyonuna yeni bir yaklaşım, polimer bazlı sistemlerin tanıtılması olmuştur.
Bunlar, çoklu enzim (HRP / AP) etiketlerinin bir polimer omurgası aracılığıyla ikincil antikora eklenmesine izin verir. Bu tür bir sistem iki aşamalı bir prosedürdür ve bu nedenle geleneksel avidin / biyotin sistemlerine göre zamandan tasarruf sağlarken çoklu enzim etiketleri hassasiyeti korur.