Enzim Histokimyası
Enzimler, çoğu biyolojik reaksiyon için katalizör görevi gören ve insanda homeostazı korurken hücresel metabolizmada hayati öneme sahip olan büyük üçüncül proteinlerdir. Her biri belirli moleküller (alt tabakalar) üzerinde etki ederek belirli bir reaksiyonu katalize eden 700’den fazla bilinen enzim vardır. Ortaya çıkan reaksiyon ürünü, Krebs döngüsünde gösterildiği gibi farklı bir enzim için yeni bir substrat görevi görebilir. Her metabolik reaksiyondan sonra, her durumda enzim, diğer etkileşimler için değiştirilmeden bırakılır.
Biyokimyacılar, teşhis ve araştırma araştırmaları için vücut sıvıları, doku kültürleri ve rezeke edilen dokudan türetilen solüsyonlardaki enzim seviyelerini rutin olarak inceler. Bu, hastalık süreçlerinin saptanması ve izlenmesinde ve ilaca bağlı fizyolojik değişikliklerin değerlendirilmesinde değerli kanıtlar sağlar.
Bununla birlikte, biyokimyasal analizlerle elde edilen sonuçlar, dokularda bulunan heterojen bir hücre popülasyonu ile ilgilidir ve spesifik hücresel değerler vermez. Hücre içi enzim konumu ve biyolojik aktivitenin daha doğru bir değerlendirmesi, enzim histokimyası kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Bu, doku kesitlerine veya lekelere bir enzim saptama sisteminin uygulanmasına dayanır. Bu teknik, enzim aktivitesi ile orantılı bir yoğunluk ile hücrelere lokalize olan son bir renkli reaksiyon ürünü üretir.
Biyokimyasal yöntemlerin aksine, bu yoğunluğun ölçülmesi zordur, ancak deneyimli bir patolog tarafından görülen kalitatif mikroskobik görünümler, çeşitli hastalık süreçlerinin histolojik tespiti ve değerlendirilmesinde daha önemlidir.
Enzim histokimyası ile ilgili temel sorun, doku hazırlama ve histokimyasal boyama sırasında enzim fonksiyonunun tutulmasıdır. Spesifik enzimler için çok sayıda histolojik yöntem geliştirilmiştir ve bu yöntemler zor olmasa da, gerekli standart dışı doku işleme prosedürleri bu tekniklerin genellikle uzmanlaşmış laboratuvarlarda uygulanmasına neden olmuştur.
Standart parafin kesitlerinde enzim tespiti için diğer enzim dışı histokimyasal yöntemler arasında immüno-histokimya ve mRNA in situ hibridizasyon yer alır. Bu yöntemler, hücresel enzimlerin varlığını veya üretimini belirleyebilir, ancak hiçbiri enzimin biyolojik aktivitesini gösteremez.
Patoloji histokimyasal boyalar
Histokimyasal yöntemler
Histokimyasal ve immunohistokimyasal boyalar
İmmünohistokimyasal bulgular
Histokimyasal teknikler
Histokimyasal boyalar hangi amaçla kullanılır
Histokimyasal boyama en sık kullanılan
İmmünohistokimya işlem Basamakları
Yapı ve Sınıflandırma
Yapısı
Enzimler, sitoplazma içinde serbest bulunabilen (liso-enzimler) veya hücresel zarlara (desmo-enzimler) bağlanan yüksek moleküler ağırlıklı globüler proteinlerdir. Aktif bir dördüncül yapı oluşturmaya yardımcı olabilecek enzime protein içermeyen bileşenler (prostetik gruplar) bağlanabilir. Enzimin fonksiyonel özelliği, enzim / substrat etkileşimi sahasındaki “aktif bölgesinin” şeklini ve yükünü korumasına bağlıdır.
Çoğu enzim reaksiyonu için çeşitli ko-faktörler gereklidir. Kalsiyum, manye- siyum, manganez, sodyum, potasyum iyonları ve diğerleri gibi aktivatörler enzimatik reaksiyon sırasında elektron transferine yardımcı olur.
Ko-enzimler, aktif olmayan bir “apoenzim” ile birleşen ve apoenzimin kuaterner yapısını değiştirerek sterik olarak aktif bir bölge üreten moleküllerdir. Ko-enzim ayrıca substrat ile birleşebilir ve metabolik reaksiyonda aktif bir rol oynayabilir. B vitaminlerinin çoğu ko-enzimlerdir.
Sınıflandırma
Enzimleri sınıflandırmanın birkaç yolu vardır, en doğrusu enzimin sistematik adına dayalı olarak enzim kod numarasıdır. Bu, reaksiyona girilen spesifik substratın adını ve ardından “ase” son ekiyle, ilgili reaksiyon türünü belirten bir kelimeyi içerir. Tanısal enzim histokimyasında, araştırılan enzim sayısının az olması nedeniyle daha kısa önemsiz bir ad daha yaygın olarak kullanılmaktadır.
Altı ana enzim grubu, substrat üzerindeki etkilerine göre sınıflandırılır; oksidoredüktazlar, transferazlar, hidrolazlar, liyazlar, izomerazlar ve ligazlar. Muhtemelen, teşhis enzimi histokimyacı için en önemli gruplar oksidoredüktazlar (daha önce oksidazlar ve dehidrojenazlar olarak biliniyordu) ve hidrolazlardır. Bunlar genellikle sırasıyla “oksidatif” ve “hidrolitik” enzimler olarak adlandırılır.
Koruma ve Hazırlık
Enzim koruması
Fiksasyon, dehidrasyon ve parafin mumuna gömme gibi geleneksel bir parafine gömülü doku bloğunun üretiminde gerekli olan işleme aşamalarının kümülatif etkileri, fonksiyonel enzimlerin korunmasına elverişli değildir.
Kloroasetat esteraz ve peroksidaz parafin işlemeden kaynaklanan hasara yeterince dirençli olmasına rağmen, bu prosedürler genellikle enzim aktivitesinin tamamen kaybıyla sonuçlanır. Sonuç olarak, çoğu enzimin gösterileri genellikle donmuş bölümler üzerinde gerçekleştirilir, ancak lekeler gibi diğer preparatlar da kullanılabilir.
Çeşitli enzimlerin dış etkilere farklı tepki verdiğini hatırlamak önemlidir, ancak taze doku oda sıcaklığında bırakılırsa çoğu enzim hızla kaybolur. Kas hastalığını araştırırken tanısal olarak önemli olan birçok oksidatif enzim mitokondride de bulunur.
Taze doku oksijenden mahrum kaldığında, mitokondriyal zarlar hızla zarar görür ve enzim aktivitesinde azalma meydana gelir. Bu nedenle, oksidatif enzimlerin çoğu geleneksel fiksasyona dayanamadığı için, genellikle taze olan dokuyu hızla dondurmak da önemlidir.
Hidrolitik enzimler lizozomlarda bulunur, ancak donma ve ardından blokların veya bölümlerin enzimlerin salınmasıyla çözülmesiyle zarar görürler. Hidrolitik enzimlerin difüzyonu en aza indirilebilir ve doku kriyotomiden önce bir fiksatif ile tedavi edilirse lokalizasyon iyileştirilebilir, ancak enzim aktivitesinde bir miktar kayıp meydana da gelecektir.
Uygulamada, enzim histokimyasal boyama, özellikle tanıda bir gecikmenin istenmediği veya aynı numunede farklı enzimlerin gösterilmesinin gerekli olduğu klinik durumlarda, genellikle sabitlenmemiş kriyostat bölümleri üzerinde gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bazı enzimlerin lokalizasyonu, kriyotomi sonrası doku bölümünün kısaca sabitlenmesi ile de iyileştirilebilir.
Fiksasyon uygulanırsa, fiksatif 4 C’de olmalı ve mümkün olan en kısa süre kullanılmalıdır. Formol kalsiyum, çoğu durumda tamponlu formalin veya formal salin tatmin edici olmasına rağmen, hücre zarı bütünlüğünün korunmasına yardımcı olduğundan, doku blokları için sıklıkla tavsiye edilir. Kriyotomi ve enzim aktivitesi, sabitlenmiş dokunun donmadan önce bir sükroz tampon çözeltisi içinde yıkanmasıyla daha da geliştirilebilir.
Optimal sonuçlar için, bu solüsyonların dokunun fizyolojik pH’ına yakın tutulması önemlidir. Aseton, formalin buharı ve formalin-alkol karışımları dahil olmak üzere, smear ve kriyostat kesitlerinde formol kalsiyumun yanı sıra çeşitli fiksatifler de kullanılmıştır.