Blog

Elektrokimyasal Dedektörler – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri - Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Elektrokimyasal Dedektörler HPLC ile kombinasyon halinde elektrokimyasal algılama, kolayca oksitlenebilir ve indirgenebilir organik bileşiklerin ölçümü için son on yılda giderek daha popüler hale geldi. Bu hızlı ilgi genişlemesi, merkezi sinir sisteminden biyojenik aminlerin miktar tayininde kullanımının tanınmasıyla tetiklendi. Daha yaygın kullanım, tekniğin kendine özgü avantajları, bunlar seçicilik, yüksek hassasiyet ve düşük maliyetle desteklenmiştir. Elektrokimyasal dedektörler iki sınıftır: (a) Detektör hücresinden akan hacimli sıvının elektrokimyasal özelliğindeki değişiklikleri ölçen yığın özellik detektörleri. Bu sınıftaki en popüler detektörler, hücre boyunca bir potansiyel uygulayan iletkenlik detektörleridir, böylece çözelti içindeki iyonlar, iletkenlikte sonuç olarak bir değişiklikle çekici elektroda doğru hareket eder. İletkenlik detektörlerinin iki ana dezavantajı, mobil fazda tampon tuzlarının kullanımından genel olarak kaçınılması ve ayrıca sistemin sıcaklığa duyarlı olmasıdır. Bununla birlikte, bu detektörler hem organik hem de inorganik iyonların miktar tayininde bir miktar kullanım bulmuşlardır. (b) Bir çözünen detektör hücresinden geçerken potansiyel veya akımdaki değişikliği izleyen çözünen özellik detektörleri. Bu dedektörler arasında daha popüler olanı ya kulometrik ya da amperometriktir; ikincisi şu anda daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu dedektörlerin ayrıntılı teorisi bu çalışmanın kapsamı dışındadır ve ilgilenen okuyucu başka bir yerde belirtilmiştir. Bununla birlikte, kısaca, eğer bir çözünen, bir elektron transferi için yeterince yüksek olan sabit bir potansiyelde tutulan bir elektrotun üzerinden geçerse ve bunun sonucunda oksidasyon veya indirgeme meydana gelirse, çözünen konsantrasyonu ile orantılı bir akım üretilecektir. Gaz kromatografisi Gaz kromatografisi Dedektörleri HPLC dedektörleri DAD dedektör Gaz kromatografisi çalışma prensibi gc-fid çalışma prensibi Alev iyonizasyon dedektörü FID dedektör çalışma prensibi Amperometrik detektörlerde detektöre giren ve çıkan çözünen madde konsantrasyonu aynıdır (pratikte% 5'e kadar ürüne dönüştürülebilir). Kulometrik detektörlerde çözünen madde tamamen dönüştürülür (genellikle yaklaşık% 95 dönüşüm). Kulometrik dedektörler tarafından verilen sinyal açıkça daha büyük olsa da, arka plan akımındaki artış ve buna bağlı olarak sinyal / gürültü oranındaki düşüş bu avantajdan daha ağır basıyor. Amperometrik dedektörlerle kullanılan çalışma elektrotları, hem HPLC moduna hem de oksidatif veya indirgeyici elektrokimyasal saptamanın kullanılıp kullanılmadığına bağlıdır. Oksidatif modda, çalışma elektrodu genellikle karbon macunu veya camsı karbondur. Karbon macunu, grafit ve parafin yağı, silikon gres veya mum gibi atıl bir bağlayıcı malzeme karışımıdır. Bu elektrotların hazırlanması kolaydır, düşük arka plan akımlarına sahiptir ve makul ölçüde yeniden üretilebilir. Ne yazık ki, bunların kullanımı, organik modifiye edicinin düşük bir konsantrasyonda olduğu mobil fazlarla sınırlıdır (örneğin,% 25'ten (v / v) metanol veya% 5 (v / v) asetonitril). Camsı karbon, kimyasal olarak dirençli, mekanik olarak sert, camsı bir malzemedir. Camsı karbon ve karbon macunu elektrotlarının hassasiyeti benzerdir, ancak ikincisi bazen daha düşük arka plan akımlarına sahiptir. İndirgeyici elektrokimyasal saptamada kullanılan elektrotların en popüler olanı, altın bir substrat üzerinde ince bir film olarak biriktirilen civadan oluşan bir elektrot kullanır. Bu tasarım, cıva damla elektrotlarının eski tasarımında gözlemlenen titreşim ve mekanik kararsızlık sorunlarının üstesinden gelir. Elektrokimyasal saptamayla ilgili önemli bir sınırlama, sınırlı mobil faz seçimidir çünkü polar olmayan organik çözücülerin yüksek konsantrasyonları, iletkenliği destekleyemedikleri için kullanılamaz. Tamponlar mobil fazda kullanıldığında, düşük bir arka plan akımını korurken iletkenlik sağlamak için genellikle 0,01-0,1 M aralığındadır. Aşırı arka plan akımlarını önlemek için mobil fazın bileşenlerinin her zaman en yüksek saflıkta olması gerektiği vurgulanmalıdır. Elektrokimyasal algılamada kullanılan en popüler dedektör hücreleri ince tabakadır ve amperometrik veya kulometrik dedektörlerle kullanılabilir. En popüler tasarım (Biyoanalitik Sistemler), elektrot yüzeyine paralel mobil faz akışına ve çalışma elektrotunun karşısına yerleştirilmiş, ince katman kanalının referans elektroda bir tuz köprüsü olarak işlev gördüğü bir düzlemsel yardımcı elektrota da sahiptir. Alternatif bir tasarım, akışın elektrot yüzeyine dik olduğu duvar jeti detektörüdür; bununla birlikte, bu hücre elektrot yüzeyine daha etkili kütle transferi sağlamak üzere tasarlanmış olmasına rağmen, geleneksel hücreler genel olarak üstün performans da sergilemiştir. Elektrokimyasal dedektörlü uygulamaların çoğunda tek bir elektrot kullanılır; bununla birlikte, karşılıklı olarak konumlandırılmış karşılık gelen bir yardımcı elektrot ve aşağı yönde bir referans elektrot ile paralel olarak iki çalışma elektrotunu kullanan bir çoklu elektrot sistemi tasarlamak nispeten daha da basittir. Bu düzenleme, akımın iki potansiyelde izlenmesine izin verir ve bu nedenle UV dedektörleri ile iki farklı dalga boyunda izlemeye benzer. Bu yöntem, ayrıştırılan bir çözünen maddenin tanımlanmasına yardımcı olmak için kullanılabilir ve ayrıca, daha yüksek potansiyellerde reaksiyona giren maddelerin varlığında kolayca oksitlenen bir çözünen maddenin miktarını belirlemek için kullanılabilir, böylece ilave algılama hassasiyeti de sağlar. Elektrokimyasal tespit uygulamalarının kapsamlı bir incelemesi bu kitabın kapsamı dışındadır. Kısaca, en sık araştırılan bileşik sınıfları arasında; aromatik aminler, fenoller, tioller, nitro-bileşikler, kinonlar, fenotiyazinler, pürinler ve semikarbazidler. Ek olarak, hem askorbik asit hem de ürik asit, elektrokimyasal tespit kullanılarak uygun şekilde de izlenebilir. Hassas tespit elde etmek için kılavuz olarak elektrokimyasal dedektörlere özel olarak uygulanabilen bir dizi ipucu verilebilir: (a) Elektrotun mobil faz ile uyumlu olduğundan ve elektrot yüzeylerinin iyi durumda olduğundan emin olun. (b) İlgili çözünen maddeyi oksitlemek veya azaltmak için gereken minimum potansiyelde çalışın. (c) Dedektörün elektriksel olarak izole edildiğinden ve tüm bileşenlerin aynı ortak toprak bağlantısına topraklandığından emin olun. (d) Dedektör hücresi etrafındaki sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirin. (e) Akış hücresinde hava kabarcığı olmadığını kontrol edin. (f) Mobil fazın tüm bileşenlerinin en yüksek kalitede olmasını sağlayın. (g) HPLC sistemini düzenli olarak pasifleştirin.

Elektroforez-Sodyum Dodesil Sülfat – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi – FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri

Kapiler Elektroforez-Sodyum Dodesil Sülfat

Mikro ölçekli ayırma teknolojilerinin evrimi, CE-SDS gibi kılcal tabanlı tekniklerin, proteinlerin ve antikorların hidrodinamik boyutunu belirlemek için SDS-PAGE’nin yerini almasına izin verdi. CE-SDS, değiştirilebilir polimer jel matrisi ile doldurulmuş bir kapiler ve ayırma için yüksek voltaj uygulaması kullanır.

Cihaz, kontrollü bir ortamda otomasyona izin vermek için genellikle bir çevrimiçi otomatik örnekleyici, güç kaynağı ve bir UV / foto diyot dizisi (PDA) algılama sistemi içerir. SDS-PAGE ile karşılaştırıldığında, CE-SDS, gelişmiş çözünürlük, daha fazla doğrusal aralık ve son derece düşük kimyasal atık gibi çeşitli avantajlar sunar ve en önemlisi, kılcal absorbans tespiti niceliksel analiz sağlar.

Kapiler şartlandırma, numune enjeksiyonu, ayırma, entegrasyon ve rapor oluşturma dahil tüm süreç tamamen otomatikleştirilebilir.

Protein ayırma için CE-SDS yöntemleri genellikle hem indirgenmiş (genellikle b-merkapto etanol, BME gibi bir indirgeyici madde kullanılarak) hem de indirgenmemiş koşullar altında (genellikle iyodoasetamid (IAM) veya N-etilmaleimid (NEM SDS-PAGE gibi, CE-SDS de yüksek sıcaklıkta SDS numune tamponu kullanarak molekülleri denatüre eder.

Bir CE-SDS yönteminin geliştirilmesi aşağıdaki beş adımı içerir:

  • (1) proteinlerin tamamen denatüre olmasını ve / veya azaltılmasını sağlamak için numune hazırlama koşullarının belirlenmesi,
  • (2) analiz doğrusal aralığının belirlenmesi,
  • (3) aşağıdaki gibi ayırma parametrelerinin optimizasyonu Çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için ayırma voltajı ve sıcaklığının yanı sıra kılcal iç çap (ID) ve uzunluk (L) çalışmaları,
  • (4) hassasiyeti en üst düzeye çıkarmak için en iyi dedektör tipinin belirlenmesi ve
  • (5) veri için bir veri işleme yönteminin geliştirilmesi analizi.

1. Örnek Hazırlama

Biyofarmasötik analizde tipik bir numune hazırlama yaklaşımı şöyledir: 150 mg’lık bir protein veya antikor bölüntüsüne 3 mL dahili standart (IS, 10 kDa moleküler ağırlık işaretçisi, SDS-MW Analiz Kiti, Beckman Coulter, Fullerton, CA), 10 mL ekleyin indirgenmemiş CE-SDS (nrCE-SDS) için indirgenmiş CE-SDS veya 10 mL 250 mM IAM için düzgün BME ve SDS numune tamponu (SDS-MW Analiz Kiti, Beckman Coulter, Fullerton, CA) ile QS toplam hacim 150 mL. IAM genellikle taze olarak hazırlanır. Karışımı vorteksleyin ve sıvıyı tüpün dibine getirmek için kısa süre santrifüjleyin.

75 ° C’de 10 dakika su banyosu kullanarak tüpü ısıtın. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun, sıvıyı tüpün dibine getirmek için kısa süre santrifüjleyin ve çözeltiyi karıştırmak için tekrar vorteksleyin. Çözelti artık enjeksiyona hazırdır. Şekil 1’de bir numune hazırlama akış diyagramı gösterilmektedir.

Denatürasyon için gereken ısıtma sıcaklığı ve süresi molekülün özelliklerine bağlıdır ve bu nedenle her bir biyomolekül için optimize edilmelidir.

Sodyum Dodesil sülfat ne ise yarar
Sodyum dodesil sülfat ne ise yarar
Sodyum dodesil sülfat Nedir
Sodyum Dodesil Benzen sülfonat
Sodyum Lauril Sülfat
Sodyum dodesil sülfat Poliakrilamid jel elektroforezi
Sodyum Dodesil Sülfat fiyat
Sodyum dodesil sülfat deterjan

2. CE-SDS’de Ayırma Koşulları

Ayırma koşulları, kılcal uzunluk (L), kılcal ID, ayırma gerilimi (V) ve ayırma sıcaklığı (T) açısından optimize edilebilir.

Şekil 2, kısa bir kılcal (33.0 cm toplam) ve bir uzun kılcal (toplam 48.5 cm) kullanılarak bir proteinin CE-SDS ile ayrılmasının sonuçlarını göstermektedir. Uzun kılcal damar kullanılarak yapılan analiz daha fazla zaman alır ve azalmış hassasiyet gösterir. Daha kısa analiz süresi gerektirdiği ve daha iyi hassasiyet ürettiği için genellikle kısa kapiler tercih edilir.

Ayırma gerilimi, yöntem geliştirme sırasında çözünürlüğü optimize etmek için bir başka önemli parametredir. Şekil 3, ayırma için farklı voltajlar uygulanarak elde edilen elektroferogramların (e-gram) bir örneğini göstermektedir. Daha yüksek ayırma voltajı, daha iyi çözünürlükle daha hızlı bir ayırma sağlar; ancak dalgalı bir taban çizgisi gözlemlendi. Bu durumda, uygun temel stabilite ve profil çözünürlüğü için 15 kV seçilmiştir.

Molekül ayrışması üzerinde de önemli bir etkisi olabilen kılcal sıcaklığın etkisi Şekil 4’te gösterilmektedir. Daha yüksek bir sıcaklık daha hızlı göç sağlar; ancak, aynı zamanda temel kararsızlığa da neden olur. Tavsiyemiz 202251C kullanılmasıdır.

Hidrodinamik enjeksiyon, elektrokinetik enjeksiyonla karşılaştırıldı (veriler gösterilmemiştir). İki enjeksiyon modu, karşılaştırılabilir yüzde tepe alanları verdi. Elektrokinetik enjeksiyon, hidrodinamik enjeksiyona kıyasla biraz daha yüksek çözünürlük verdi. CE-SDS yöntemi için genellikle elektrokinetik enjeksiyon önerilir.

Genel olarak proteinler ve antikorlar için önerilen CE-SDS ayırma koşulları aşağıdaki gibidir:

  • Kılcal uzunluk
  • Kapiler iç çap (ID)
  • Ayırma gerilimi
  • Kılcal sıcaklık
  • Enjeksiyon voltajı
  • Enjeksiyon zamanı

3. CE-SDS’de Veri Analizi

Ana protein türlerinin yüzdesini hafif zincir ve ağır zincir (% LC ve% HC) ve ana olmayan yüzde ve yüksek molekül ağırlıklı türler (% ana olmayan türler ve% HMW) gibi küçük türleri ölçmek için bir antikor için elektroferogramın entegrasyonu Şekil 5’te gösterilmektedir. Düzeltilmiş tepe alanları niceleme için kullanılmıştır. Düzeltilmiş pik alanı yüzdesi olarak tanımlanır.

4. CE-SDS Yeterliliği

(a) Enjeksiyon Doğrusallığı:

Daha önce belirtildiği gibi, enjeksiyon koşulları değişen enjeksiyon süresi ve enjeksiyon voltajı ile optimize edilebilir. Şekil 6A, indirgenmiş bir CE-SDS yöntemi için 􏰔5kV’lik bir enjeksiyon voltajında ​​enjeksiyon süresine karşı pik alanının doğrusal çalışma grafiğini göstermektedir.

Bir enjeksiyon doğrusallık çalışması yapmanın avantajı, deney doğrusallık aralığı içinde büyük ve küçük protein türlerini niceleme yeteneği için yöntemi optimize etmek ve nitelendirmektir. Dahili standart (IS), LC ve HC, Şekil 5 ve 6A’da taban çizgisi çözümlendi. Bu yöntem, bu ana türlerin SDS-PAGE yönteminden (Şekil 6B) daha yüksek çözünürlüğünü sağlar.

Şekil 7, ana olmayan türler olarak adlandırılan HC, LC ve HC olmayan ve LC türler için enjeksiyon süresine karşı çizilen düzeltilmiş tepe alanı sonuçlarını gösterir. Düzeltilmiş tepe alanı değerleri, detektörden geçerken farklı moleküler boyuttaki türler arasındaki hız farklılıklarını telafi ettikleri için kullanılır. Bu sonuçlar, indirgenmiş CE-SDS yönteminin, HC, LC ve ana olmayan türler için geniş bir enjeksiyon doğrusallık aralığına (􏰔5 kV’de 5􏰔40 s) sahip olduğunu göstermektedir.

Saflığın belirlenmesinde kullanılacak azaltılmış CE-SDS yönteminin yeteneğini daha da doğrulamak için, düzeltilmiş toplam pik alanına göre her bileşen için yüzde düzeltilmiş pik alanı (% HC,% LC ve% ana olmayan) hesaplandı . Şekil 8,% HC,% LC,% ana olmayan türler ve enjeksiyon süresi arasındaki ilişkiyi göstermektedir.

Etiketler: , , , , , ,

Bir yanıt yazın