Antijene Özgü Bağışıklık Kompleksi Testi
Bir enfeksiyon sırasında meydana gelen olayların teorik bir analizini gösterir. Bir mikroorganizmanın büyümesinin artan miktarlarda mikrobiyal antijen üreteceğini ve enfekte konakçının spesifik antikor üreterek yanıt vereceğini gösterir.
Hatta başarılı bir yanıtta oluşan antikor miktarı organizmanın büyümesini baskılayacaktır. Bu diyagramdan birkaç şey dikkate alınmaya değer. İlk olarak, erken bir aşamada, ölçüm için antikordan daha fazla antijen mevcuttur. İkincisi, serbest ölçülebilir antikor yalnızca enfeksiyon seyrinde geç ortaya çıkar.
Üçüncüsü, enfeksiyonun çoğu boyunca, diyagramda taranmış alan ile temsil edildiği gibi antijen ve antikor arasında immün kompleksler oluşur. Bu immün kompleksler, enfekte eden organizmalardan antijenleri içereceğinden, ölçümleri tanıya yönelik bir yol sağlar.
Yıllardır sistemik mikrobiyal enfeksiyonların çoğunun hastanın kanında yüksek seviyelerde bağışıklık kompleksleri ürettiği bilinmektedir. Muhtemelen karmaşık ölçüm tekniklerinin geçmişte zor olması nedeniyle, bu tanımadan nadiren tanısal olarak yararlanılmıştır.
Son birkaç yılda, immün kompleks testi kullanılarak pnömokokal pnömoni, enfektif endokardit, Lyme hastalığı, cüzzam, tüberküloz menenjit ve Hepatit C virüsü enfeksiyonunun teşhisi için yöntemler tarif edilmiştir. Kullanılan tekniklerden bazıları aşağıda tartışılmaktadır.
Polietilen Glikol Kullanan Yöntemler
Bu testlerde, kompleksler polietilen glikol ilavesiyle serumdan çökeltilir. Bu işe yarar çünkü kompleksler, doğal immünoglobulin veya antijenden farklı bir boyuta sahiptir. Polietilen glikolün birkaç saat, genellikle gece boyunca çalışmasına izin verilir ve bu sürenin sonunda serum numunesi kuvvetli bir şekilde santrifüjlenir ve çökelti daha fazla analiz için çıkarılır.
Testin bir sonraki aşaması, kompleksleri bozmayı ve antijen bileşenini tespit etmeyi içerir. Bu, ısıtma (60 ° C'de 30 dakika), düşük pH tamponu (örn. Glisin / HCl) veya 1 M fosfat gibi yüksek molariteli bir tampon ilave edilerek yapılabilir. Komplekslerin bozulmasından sonra antijen, yukarıda tarif edilen yöntemlerden biri veya diğerini kullanarak, örn. ELISA.
Polietilen glikol içeren ilaç
Polietilen glikol hangi ilaçlarda var
Polietilen glikol ne ise yarar
Polietilen glikol kabızlık
Kolonoskopi öncesi barsak temizliği ilaçları
Polietilen Glikol Nedir
Polietilen glikol solüsyonu
Polietilen glikol solüsyonu nedir
Doğrudan ELISA Ölçümü
Bu testler genellikle ilgili antijenlere özgü monoklonal antikorları kullanır, mikrotitre plakalarının oyuklarına eklenir ve yakalama reaktifleri olarak kullanılır. Hastanın numunesi eklenir ve mevcut kompleksler yakalanır.
İkinci bir aşamada, bir bağışıklık kompleksi yoluyla plakanın yüzeyine bağlanan herhangi bir insan antikoruna bağlanacak olan enzim etiketli anti-insan immünoglobulin eklenir. Bu versiyon, sadece ilgili antijenleri yakalamak için monoklonal antikorların yüksek özgüllüğüne dayanmaktadır.
Ayrıca, bu yöntemle teşhisin, hastanın antikorunun ELISA plakasında yakalanan antijene bağlanmadıkça mevcut olamayacağının iddia edilmesiyle kanıtlanmadığı, yalnızca çıkarıldığı da not edilmelidir.
İmmün kompleksler için bağlayıcı ajanlar kullanan testler
Bağışıklık komplekslerini spesifik olarak bağladığı bilinen birçok madde vardır, örn. ayrılmış ve saflaştırılmış C1q (tamamlayıcının ilk bileşeni), romatoid faktör (bazı hastalarda geliştirilen ve insan IgG'sine karşı yönlendirilen bir antikor) ve konglutinin (bir sığır serum proteini), tümü bağışıklık komplekslerini bağlar.
Bu maddeler, mikrotitre plakalarına genel olarak ELISA deneyleri için açıklanan şekilde eklenebilir ve daha sonra bu maddeler, hastanın numunesinde bulunan herhangi bir bağışıklık kompleksini yakalayacaktır, kompleksin doğası daha sonra antijenlere karşı enzim etiketli bir antikor kullanılarak belirlenir.
Bu tür tahlilin kullanımına ilişkin raporların çoğu şu anda deneyseldir, ancak hız ve ekonomi sunarlar ve genellikle yukarıda açıklanan diğer yöntemlerden daha hassastırlar. Gelecekte daha sık kullanılmaya başlayabilirler.
Diğer testler - Kromatografi testleri
Yukarıda tarif edildiği gibi, mikroorganizmalardan antijenin tespiti, bir enfeksiyondaki mevcudiyetinin bir işareti olarak kullanılabilir. Aynı şekilde, organizmalardan metabolitlerin tespiti, organizmanın varlığını işaret etmek için kullanılmıştır.
Metabolitlerin tespiti ve tanımlanması, gaz-sıvı kromatografisi (GLC) veya yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile gerçekleştirilir, ancak önceki yöntem en iyi bilinen teşhis örneklerini açıklar.
GLC genellikle, bir taşıyıcı gaz akışı kullanılarak uygun bir ayırma maddesinden (örneğin Chromasorb) bir numuneyi geçirerek uçucu ve uçucu olmayan yağ asitlerini ayırmak ve tanımlamak için kullanılır. Farklı yağ asitleri farklı zamanlarda ayrılır.
Erken bir uygulama, sistemik Candida albicans enfeksiyonu olan hastaların serumunda arabinitolün tanımlanmasıydı. Başlangıçta bu metabolitin yüksek seviyelerinin yalnızca bu enfeksiyonla ilişkili olduğu düşünülüyordu, ancak sonraki araştırmalar ölçümün güvenilmez bir teşhis belirteci olduğunu kanıtladı.
Yöntemin rutin örneklerde kullanılması yaygın bir uygulama olmamakla birlikte, irin ve eksüdalarda bu tür organizmaların varlığının doğrudan belirlenebileceği söylenmektedir. Yöntemin anaerobik bakterileri, özellikle Gram-negatif organizmaları tanımlamak ve sınıflandırmak için kullanılması daha başarılı olmuştur.
Nefes testleri
Bu invazif olmayan testler, artık duodenal ülserlerin nedeni olarak kabul edilen Helicobacter pylori'yi tespit etmek için kullanılmıştır. H. pylori, solunan nefeste ölçülebilen etiketli CO2 salmak için sindirilmiş radyoaktivite etiketli üreyi hidrolize edebilen güçlü bir üreaz enzimine sahiptir.
Test için 13C ve 14C olmak üzere iki izotop kullanılmıştır: 13C daha güvenli ancak 14C'den daha pahalıdır. Testler yarı kantitatiftir ve üre mideye dağıldığı için örnekleme hatası yoktur. Bu testlerin duyarlılığı ve özgüllüğü kültür ve histoloji ile iyi karşılaştırılır. Testler H. pylori teşhisi için veya tedaviye yanıtı izlemek için kullanılabilir.
Gelecek Gelişmeler
Genel seroloji alanında çeşitli zorluklar vardır. Birincisi, sonuçların hızı sorununu ele almaktır. Yavaş bir sonuç (yani birkaç gün), bir hastanın enfeksiyonunun teşhisi ve tedavisi açısından ya akademik açıdan ilgi çekicidir ya da yararsızdır. Açıktır ki, antijen veya antijene özgü bağışıklık kompleksi saptaması, teşhis için antikor saptamasından daha hızlı bir yol sunar ve bu nedenle bu tahlillerin geliştirilmesi arzu edilir.
Ayrıca, hem antijene hem de antijene özgü bağışıklık kompleksi deneyleri tam olarak niceliksel olabilir ve seri ölçümlerle uygun şekilde kullanıldığında, herhangi bir enfeksiyonun ciddiyetini ve tedaviye yanıtı değerlendirebilmelidir. Bugüne kadar bu yöntemlerin genellikle niteliksel olarak kullanılması hayal kırıklığı yaratmaktadır ve performanslarındaki iyileşmenin, bir teknoloji değişikliğinden çok felsefedeki bir değişiklikle ilgisi olacaktır.
Gelecek için gerçek bir zorluk, yukarıdaki yöntemlerden bazılarını ortak organizmaların neden olduğu enfeksiyonlara uygulamak olacaktır. Pek çok örnek var, ancak Escherichia coli'ye bağlı ciddi enfeksiyonun teşhisi ve yönetimi faydalı bir örnek oluşturuyor.
Triasilgliseroller
Yıkama zirveleri, hareketli bir tel alev iyonizasyon detektörü ile izlendi. Karaciğerde bulunan nötr lipidlerin ve serbest yağ asitlerinin benzer bir ayrımı, sabit bir silika fazı kullanılarak gösterilmiştir.
Bu sistemde 2,2,4-tri-metilpentan-tetrahidrofuran-formikasitin (90: 10: 0.5) bir mobil fazı, bir kırılma indisi detektörü ile birlikte kullanıldı ve tepe başına -0.5-1.0 pg’lik bir alt tespit limiti sağladı. . Bu yazarlar, bu tür ayırmalarda ters faz tekniklerinin kullanılmasının, tek tek asilgliserolleri çözerek, sonuçta ortaya çıkan kromatogramı aşırı karmaşık hale getirdiği için faydasız olduğuna işaret ettiler.
Silika sabit fazlar kullanılarak, ancak alternatif mobil fazlarla benzer ayırmalar, serum lipidleri, keten tohumu yağı ve soya fasulyesi yağı ve çoklu asilgliserollerin kromatografik analizinde kullanılmıştır.
Gümüş nitrat yüklü silika sabit fazları kullanan argentasyon HPLC, 2-doymamış-1,3-doymamış (SUS), l-doymamış-2,3-doymamış (USS) dahil olmak üzere trigliseridlerin konumsal izomerlerinin analizi için kullanılmıştır. tamamen doymuş (SSS) ve tamamen doymamış (UUU) izomerler vardır.
Bu ayırmalarda, silika% 10 gümüş nitrat ile yüklendi ve kullanılan mobil fazlar ya benzen ya da toluen idi. Lipid türlerinin çözünürlüğünün, kolon sıcaklığı düşürüldükçe arttığı bulundu ve bu ayrımlarda sıcaklık, 6.0-6.8 “C’de tutuldu.
Triasilgliserollerin en erken bağlanmış faz kromatografik ayrımlarından bazıları, aseton-su-heptan artı% 1 piridin mobil fazları ile kombinasyon halinde düşük basınç koşulları altında sabit bir hidroksialkoksipropil Sep-hadeks fazı ve asit hidrolizini azaltmak için veya 2-lik bir gradyan sistemi kullanmıştır.
Bu ayrımlarda, doymamış trigliseridlerin her bir çift bağ için daha önce 1.42 metilen birimine eşdeğer olarak ayrıştırılmasıyla Cı ila Cı trigliseridlerinin iyi çözünürlüğü rapor edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, ters faz ayrışmaları, aseton-asetonitrilin mobil fazları ile birlikte ODS sabit fazlarının kullanımı üzerinde yoğunlaşmıştır.
Bu sistemlerde, ayrı ayrı tri-gliseridlerin ayrılması, ayrı ayrı esterlenmiş yağ asitlerinin zincir uzunluğu ve doymamışlık derecesi temelinde yapıldı. Yağlı asit zincirinin uzunluğu arttıkça, trigliseridlerin alıkonma süresi artarken, bir çift bağın eklenmesi, tutma süresini yaklaşık iki daha az metilen birimi olan bir trigliseridinkine düşürdü.
Triaçilgliserol
Trigliserit kimyasal formülü
Yağ asidi formülü
Doymamış yağ asitleri
Trigliserit sentezi
Trigliserit nerede depolanır
Oleik asit
Trigliserit nedir
Benzer şekilde, risinoleik asit gibi hidroksi yağ asitlerini içeren trigliseridler, normal trigliseridlerden biraz önce ayrıştırıldı ve yağlı asitlerde epoksi gruplarının varlığı da tutulma süresini büyük ölçüde azalttı.
Durağan fazın özelliklerinin de önemli olduğu gösterilmiştir, trigliseridlerin daha iyi çözünürlüğü ya artan karbon yüklemesi ya da azaltılmış partikül boyutu ile kolonlardan elde edilmiştir.
Trigliserid analizi için HPLC kullanmayı planlayan kromatografi için pratik bir değerlendirme, kolon verimliliği üzerinde alışılmadık derecede büyük bir etkiye sahip olduğu için numunenin içinde çözündüğü çözücünün seçiminde biraz dikkatli olunması gerektiğidir.
İdeal olarak, mobil faz, ekstraksiyondan sonra sulandırıcı çözücü olarak kullanılmalıdır, ancak çözünürlük sorunları nedeniyle bunun pratik olmadığı durumlarda, kullanılacak en iyi çözücü asetondur, çünkü kloroform, dietil eter ve tetrahidrofuran kullanımından kesinlikle kaçınılmalıdır.
Zincir uzunlukları ve doymamışlık dereceleri temelinde ayrı trigliserit türlerinin ayrılması için bir dizi alternatif ters faz sistemi kullanılmıştır. Örneğin, birinci geleneksel ters fazlı HPLC ayırmada,% 60 sulu metanolden oluşan bir mobil faz kullanılmıştır.
Bir asetonitril-aseton fazı için bir metanol-aseton mobil fazının ikamesinin, tutma süresinde küçük değişikliklere neden olduğu ve bir yağlı aside bir çift bağın ilk mobil fazda 2,2 karbon atomuna eşdeğer olduğu ve ikinci mobil fazda 2,4 karbon atomuna eşdeğerdir.
Bir mobil asetonitril-tetrahidrofuran-heksan fazının, kritik trigliserit çiftlerinin çözülmesinde yararlı olduğu gösterilmiştir. Metilen klorür-asetonitril veya tetrahidrofuran-asetonitrilin mobil fazlarında tributirin, trikaprilin, trilaurin ve tripalmitinin benzer kromatografik ayrımları bildirilmiştir.
Bir gradyan HPLC sisteminde propiyonitril-asetonitril karışımlarının kullanımının, trigliseridlerin ayrı moleküler türlerinin iyi çözünürlüğünü sağladığı yakın zamanda gösterilmiştir ve iki çözücünün kesin oranının aseton-asetonitril karışımlarından daha az kritik olduğu öne sürülmüştür.
Bununla birlikte, bir uyarı olarak, propiyonitril, aksi takdirde çözücüde birikebilecek alkali safsızlıkları gidermek için kullanımdan önce fosforlu pentoksit üzerinde damıtılmalıdır.
Son olarak, metanol-2-propanolün mobil fazı (3: 1) artı 0.05 N gümüş klor oranı ile kombinasyon halinde bir ODS kolonu kullanılarak oldukça alışılmadık bir mobil faz ve sabit faz kombinasyonu rapor edilmiştir.
Sabit faza gümüş iyonlarının eklenmesinin trilino-lenin, triolein ve trielaidinin çözünürlüğünü iyileştirdiği, ayırmaların zincir uzunluğu ve doymamışlık derecesi temelinde gerçekleştirildiği bildirilmiştir.
Yukarıda açıklanan ters faz ayrımlarında elüsyon zirvelerini izlemenin en popüler yöntemleri, refraktif indeks detektörleri ve alev iyonizasyon detektörlerinin kullanılması olmuştur.
İkincisi artık ticari olarak mevcut olmasa da, refraktif indeks detektörlerindeki teknolojik gelişmeler sürekli olarak alt tespit limitlerini geliştirmektedir ve trigliseridler için bu 0.5-1.0 pg aralığındadır. Sulu olmayan ters faz sistemi, 1700 cm- ‘dalga boyunda bir kızıl ötesi detektör izleme ile kombinasyon halinde kullanılmıştır.
Daha yakın zamanlarda, trigliseridler, doğrudan bir sıvı arayüz yoluyla kabul edilen kolon eluentiyle bir dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilmiştir.
Bu tekniği kullanan bir numune için tespit limiti yaklaşık 50 ng idi, ancak kolon eluentinin sadece% 1’i kütle spektrometresine enjekte edildiğinden kolon enjeksiyonu için en az 100 kat daha fazla materyal gerekliydi.
Son olarak, açilgliserollerin ve trigliseridlerin moleküler türlerinin ayrıştırılması için jel geçirgenlik kromatografisi kullanılmıştır. Tetrahidrofuran ile ayrıştırılan stiragel kolonlar, serbest gliserol ve mono-, di- ve triasilgliserollerin ayrıştırılması için kullanılmış olup, eluent bir kırılma indisi detektörü ile izlenmektedir.
Trigliseridlerin serum lipoproteinleri içindeki dağılımı, 0.15 M sodyum klorür ile ayrıştırılan bir TSK GEL permeasyon kolonu kullanılarak da analiz edilmiştir.
Ayrıştırılan trigliseridler, son aşama N-etil-N- (3-metilfenil) -N-asetiletilendiamin bileşiğinin 550 nm’de güçlü bir şekilde emilen bir kinon diamin boyasına dönüştürüldüğü bir dizi sütun sonrası enzimatik türevlendirme reaksiyonuna tabi tutuldu. . Bu türetme prosedürünü kullanan alt saptama sınırının, yıkanan tepe başına yaklaşık 1 pg olduğu bildirildi.