Doku Patolojisinde Kantitatif Yöntemler
Ölçüm uygulaması, gözlemleri objektif, tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde karşılaştırmak için bir araç sağladığından, bilimsel araştırmanın neredeyse tüm yönlerinin merkezinde yer alır.
Teşhis patolojisi, başlangıcından itibaren, büyük ölçüde doku morfolojisinin mikroskopi ile görsel olarak değerlendirilmesine, hastalığı sınıflandırmak için görsel teşhis ipuçlarının kullanımına ve bu sürecin nasıl gerçekleştirilebileceğini anlatmak için tanımlayıcı, dilsel kriterlerin kullanımına dayanmaktadır.
Histoloji ve sitopatolojide klinik olarak ilgili morfolojik ipuçlarını belirlemede muazzam ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, tanısal patoloji öznel bir süreç olmaya devam etmektedir ve bu, genellikle hem farklı patologlar arasında hem de farklı durumlarda aynı patolog tarafından tanısal sınıflandırmada zayıf tekrarlanabilirlikle sonuçlanmaktadır.
Displazi gibi erken malignitenin derecelendirilmesi böyle bir örnek sağlar. Çalışmalar servikal displazi derecelendirmesinde 0.15, oral displazide 0.27 ve bronş pre-invaziv lezyonlarında 0.55 kadar düşük (kappa) değerler göstermiştir. farklı gözlemciler arasındaki uzlaşmanın bir ölçüsüdür ve 0 (uzlaşma yok) ile 1 (mükemmel uyum) arasında değişir.
Servikal sitolojide,% 2'lik hata oranları 0,46 gibi düşük değerlerle belirtilmiştir ve doku bölümlerinden servikal intraepitelyal neoplazinin derecelendirilmesi vakaların% 36'sına kadar anlaşmazlık göstermiştir.
Bu sonuçlar, morfolojik değişiklikleri çıplak gözle doğru ve tutarlı bir şekilde derecelendirebilmekte var olan zorluğun altını çizmektedir. Bu nedenle, umutsuzca ihtiyaç duyulan nesnelliği, tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği sağlayan tanıya yeni yaklaşımları keşfetme fırsatları vardır.
Histolojik ve sitolojik özelliklerin ölçümünün, patolojide tanısal kararlar alma becerimizi önemli ölçüde geliştirebilecek objektif veriler sağlayabileceği uzun zamandır kabul edilmiştir. Patolojide ölçüm, morfometri, kantitatif mikroskopi, kantitatif patoloji, görüntü analizi ve matematiksel morfoloji dahil olmak üzere birçok farklı şey olarak adlandırılmıştır. Patolojide ölçümün bir dizi farklı avantajı vardır.
Çıplak gözle gördüğümüz morfolojik değişiklikleri sayısal terimlerle tanımlamamızı sağlar. Bu bize objektif, tekrarlanabilir ve doku morfolojisindeki değişiklikler hakkında istatistiksel olarak belirli hipotezleri test etmek için kullanılabilen nicel veriler sağlar.
Buna ek olarak, ölçüm çıplak gözle kolayca görülemeyen ince, "alt görsel" özelliklerin algılanmasına olanak tanır. Her iki durumda da ölçüm, morfolojik anormalliklerin objektif yorumlanması ve insan hastalıklarının kantitatif sınıflandırması için paha biçilemez bir araç olabilir.
Patoloji doku takibi AŞAMALARı
Patoloji nedir
patoloji nedir, ne iş yapar
Ameliyat sonrası patoloji sonucu
Patoloji sonucu temiz çıkarsa
Patolojik nedir
Patoloji raporu yorumlama
Patoloji bölümü
Yöntemler
Mikroskopiden kantitatif bilgi elde etmemize izin veren çeşitli yöntemler vardır. Basit doğrusal ölçümler, herhangi bir mikroskobun oküler tüpüne yerleştirilebilen, üzerine mikroskobik bir cetvel veya belirli boyutlarda bir ızgaranın oyulduğu düz bir cam parçası kullanılarak bir göz parçası ızgarası kullanılarak yapılabilir.
Bu, numunenin görüntüsünü kaplar ve kantitatif verileri çıkarmak için kullanılabilir. Basit bir ayarda bu, doğrusal derinlik veya kalınlık mesafelerini ölçmek için kullanılabilir.
Öte yandan stereoloji, görüntüyü kaplayan nokta veya çizgi probları kullanan bir yaklaşımdır. Basit olmasına rağmen, iki boyutlu görüntülerden (yani doku bölümleri) üç boyutlu ölçümleri (örneğin hacim, yüzey alanı, uzunluk) çıkarmak için hala önemli bir değere sahip olan eski ve köklü bir tekniktir.
Bu yöntemler artık patolojik araştırma ve uygulamalarda nadiren uygulanmaktadır. Bunun nedeni, etkisiz olmaları değil, daha ziyade otomasyon ve çok sayıda numunenin analizinin, bilgisayarı patolojide ölçüm için merkezi araç haline getirmesidir.
Bu, uygun yazılımla, doku ve hücre örneklerinin mikroskobik görüntülerinden doğrusal, stereolojik ve daha karmaşık morfolojik parametreleri ölçmekten daha fazla yeteneğe sahip olan standart kişisel bilgisayarların her yerde bulunmasıyla daha da geliştirilmiştir.
Bilgisayarlar
Bilgisayarların tıbbi uygulama ve araştırmanın birçok yönü üzerinde büyük bir etkisi olmuştur. Patolojide, bilgisayarlar artık patoloji raporu oluşturma, örnek tanımlama ve dijital fotomikroskopi için hasta bilgi sistemleri olarak laboratuvar altyapısının önemli bir parçasını oluşturmaktadır.
Bilgisayarlar ayrıca ışık mikroskobunda doku ve hücre ölçümü için ana araç haline geldi. Bir doku veya hücre yapısının profil koordinatları ile sunulduğunda, yazılım, alan, çevre, maksimum çap, minimum çap, şekil faktörü vb. Gibi bu profille ilgili çeşitli ölçümleri çok hızlı bir şekilde hesaplayabilir.
Bu bilgiler elektronik olarak bir veri tabanında saklanabilir ve teşhis gruplarını, farklı prognozlu hastalardan alınan doku örneklerini ve tedaviyi takiben morfolojik değişiklikleri karşılaştırmak için istatistiksel olarak analiz edilebilir. İki tür bilgisayar tabanlı teknik genel olarak tanımlanabilir.
Bilgisayar Destekli İnteraktif Ölçüm
Bu yaklaşım, ölçülecek doku veya hücre yapılarının sınırlarının izlenmesi veya işaretlenmesi için tamamen insan kullanıcısına dayanır. Fare veya daha özel bir dijital kalem ve çizim tableti olabilecek ekli bir çizim cihazına sahip bir bilgisayardan oluşur. Belirli bir nesnenin sınırını izleyerek, x; y koordinatlar sistem tarafından kaydedilir.
Bunlar, boyut ve şeklin özelliklerini ölçmek veya dansitometrik ölçümlerin hesaplanabileceği sınırı tanımlamak için kullanılabilir. Basit fotomikrograflardan, video kamera kullanılarak bilgisayar ekranına aktarılan canlı görüntülerden veya dijital olarak depolanan görüntülerden sınırlar izlenebilir.
Çoğu masaüstü bilgisayar, etkileşimli ölçüm cihazları olarak işlev görecek şekilde kolayca ayarlanabilir. Ölçümü kolaylaştırmak için yazılım ticari olarak mevcuttur. Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından geliştirilen ücretsiz yazılım da Scion Imaging'den edinilebilir. Bu nedenle bu yaklaşım ucuzdur, uygulaması kolaydır ve çok çeşitli uygulamalarda kullanılmıştır.
Patolojide Dijital Görüntüler
Mikroskobik görüntüleri dijital olarak kaydedebilmemiz, çok sayıda görüntüyü uygun ve yönetilebilir bir biçimde elektronik olarak saklama ve ayrıca niceliksel değerlendirme için bu görüntülerden sayısal bilgileri hızla çıkarma becerimiz üzerinde büyük bir etkiye sahip olmuştur.
Hareketsiz dijital kameralar, standart bir adaptör kullanılarak bir mikroskoba kolayca takılabilir. Burada kamera, görüntüyü daha sonra işleme ve analiz için bir bilgisayara aktarılan dahili bir hafıza kartına kaydeder.
Alternatif olarak, dijital veya analog video kameralar bir mikroskoba bağlanabilir ve görüntüler, uzman bir görüntü sayısallaştırma kartı aracılığıyla doğrudan bilgisayar tarafından dijitalleştirilebilir. Her iki yaklaşım da işe yarar, ancak özel uygulamalar için deklanşör hızı, kazanç ve renk sıcaklığı gibi kamera ayarlarının kontrolü hayati önem taşır.
Bir asidik fosfat tamponu ilave edilerek iyonik kuvvetin arttırılması, tek tek nükleotidler tutulmuş ve çözülmüştür. Bir fosfat tamponuna (pH 5.0) metanol veya asetonitril (% 5) gibi bir organik modifiye edicinin eklenmesi, çok kararlı bir taban çizgisini korurken nükleotitlerin çözülmesini kolaylaştırır.
Ters fazlı HPLC, adenozinin dört monofosfatının, yani 2′-, 3′-, 5′- ve 2 ‘, 3′ fosfatların ayrılması için başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, 2′-deoksiadenosin, 2′-deoksitimidin ve 3’-deoksiguanozin nükleotidlerinin çözünürlüğü için eşit derecede faydalıdır.
Mobil fazda eklenen organik çözücü konsantrasyonu, muhtemelen sabit fazdaki alanlar için rekabet ederek, retenasyonu azaltan yüksek konsantrasyonlu ayırmaları güçlü bir şekilde etkiledi. Nükleotidlerin elüsyon sırası genellikle bileşiklerin hidrofobikliği ile ilişkilidir.
Ters Fazlı İyon Çifti HPLC
Ters faz modu, çoğu nükleotit tarafından yaygın olarak kullanılan pH değerlerinde taşınan negatif yük nedeniyle nükleotitlerin ayrılması için bariz sınırlamalara sahiptir; bu, hem zayıf tutmaya hem de çözünürlük eksikliğine neden olabilir.
Mobil faza bir iyon eşleştirme reaktifinin eklenmesi, bu problemlerin üstesinden gelmek için kullanılabilir. Böylece, iyon eşleştirme reaktifi olarak tetra-n-butilamonyum hidrojen sülfat içeren bir gradyan mobil faz kullanılarak on iki nükleotid fosfat çözüldü.
Bakteriyel hücrelerden nükleotidlerin ayrılmasında iyon değişimi, ters faz ve ters faz iyon çifti kromatografisinin bir karşılaştırması, ikinci yöntemin analitik ayırmalar için tercih edilebilir olduğu sonucuna varmıştır. Elde edilen çözünürlük, büyüme koşullarının hücre içi nükleotid seviyeleri üzerindeki etkisinin ayrıntılı analizine izin verdi.
Ters faz iyon çifti kromatografisi kullanılarak nükleotidlerin ayrılması için optimum mobil faz koşullarının, karşı iyon olarak tetrabutilamonyum fosfat (TBAP) içeren bir fosfat tamponu olduğu bulunmuştur.
50 mM ile 120 mM arasındaki fosfat konsantrasyonları en iyi çözünürlüğü verirken, 0.5 mM ile 2.0 mM arasındaki konsantrasyonlarda TBAP ilavesi çözünürlük ve tutma süresini önemli ölçüde artırdı. 2.0 mM’den yüksek konsantrasyonlar, çözünürlüğü iyileştirmeden tutmayı artırdı.
Bir organik çözücünün (özellikle asetonitril) eklenmesi, çözünürlük üzerinde çok az etkiye sahipken tutmayı azaltmak için kullanılabilir. Mobil fazın pH değerinin varyasyonları, yakından ilişkili nükleotid çiftleri arasındaki seçiciliği modifiye etmek için kullanılabilir.
Polinükleotit zinciri nedir
Oligonükleotid primer nedir
Oligonükleotid Nedir
Pcr nedir
PCR aşamaları
Polinükleotit nedir
Dntp Nedir
polimeraz zincir reaksiyonu (pcr nedir)
Normal Fazlı HPLC
Doğal nükleotidler, normal faz modunda kromatografiye izin vermeyecek kadar kutupsaldır, ancak DNA’nın kimyasal sentezi için öncül olarak kullanılan kimyasal olarak değiştirilmiş nükleotidler çok daha az kutupsaldır.
Bu sentetik moleküllerdeki tüm reaktif bölgeler kimyasal olarak bloke edilir ve nötr, lipofilik bileşiklerdir; bu nedenle, ayrılmaları için tercih edilen analitik ve hazırlayıcı mod, normal faz silika adsorpsiyon kromatografisidir.
Oligo ve Polinükleotidler
Hem doğal hem de sentetik genetik materyalin saflaştırılması, rekombinant DNA araştırmalarında temel öneme sahiptir. Örneğin, ilk enzimatik sindirim ve müteakip saflaştırma ile DNA sınırlama fragmanlarının oluşturulması, sekans analizinin veya genetik rekombinasyonun ortadan kaldırılmasına izin verir.
Ek olarak, spesifik haberci RNA fraksiyonlarının preparatif ayrılması, tamamlayıcı DNA sekanslarının üretimi ve klonlanması için özellikle değerlidir. Ayrıca, nükleik asitleri kimyasal olarak sentezleme yeteneğindeki son gelişmelerle birlikte, oligonükleotitlerin kimyasal yan ürünlerden saflaştırılması, işlevlerinin doğruluğunu sağlamak için gereklidir.
Sulu çözeltideki nükleik asitlerin baskın özelliği, bu molekülleri iyon değişim kromatografisi ile ayırma için ideal aday yapan fosfat gruplarının iyonik doğasıdır.
Ters faz ayrımları, nükleik asit bazlarının zayıf hidrofobik doğası kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Doğal nükleik asitler, birçok farklı boyut sınıfında meydana gelir ve boyut dışlamayla grup ayrımları (örneğin ribozomal RNA ve transfer RNA arasında) da etkili olabilir. Bu yöntemlerin göreceli avantajları aşağıdaki bölümlerde açıklanmaktadır.
Anyon Değişimli HPLC
Nükleik asitlerin güçlü anyon değişimli durağan fazlar kullanılarak ayrılması çok popüler hale gelmiştir. Ayrılmalar, moleküllerin yüküne ve bunların silika desteğe bağlı üçüncül amonyum grupları ile etkileşimlerine bağlıdır.
Bu mod, küçük moleküllerin (21 nükleotid uzunluğundan daha az) çözünürlüğü için özellikle yararlıdır, çünkü n ve n +1 moleküllerinin nispi çözünürlüğü artan uzunluklarla (n) azalır.
Sabit fazın çözünen ve üçüncül amonyum ayırıcı kolu arasındaki hidrofobik kuvvetler, ayrılmayı etkileyebilir, ancak sulu tampon eluentine organik bir çözücünün eklenmesiyle en aza indirilebilir. Bununla birlikte, güçlü anyon değişim kolonlarından daha uzun moleküllerin geri kazanılmasının, sabit faza geri döndürülemez bağlanma nedeniyle nispeten düşük olduğuna dikkat edilmelidir.
Fosfat tamponları içeren mobil fazlar, oligodeoksinükleotidlerin preparatif saflaştırılmasında sıklıkla kullanılmaktadır, ancak, ürünün sonradan tuzdan arındırılması gerekliliği, bu tür mobil fazların kullanımını sınırlar: ayrıca, moleküller arası ve moleküller arası etkileşimler (hidrojen bağı) ile ilişkili problemler ortaya çıkabilir. – eluentte formamid dahil edilerek bunlar büyük ölçüde aşılabilir.
Alternatif bir mobil faz, liyofilizasyon ile çıkarılabilen ve içinde bu moleküler etkileşimlerin sınırlı olduğu sulu trietilamonyum asetattır. Silikanın polietilenimin ile yerinde yüzey modifikasyonu rapor edilmiştir ve oligonükleotitlerin zincir uzunluğu 35’e kadar çözünürlüğünü sağlar.
Büyük gözenek boyutuna sahip mikropartikülat iyon değiştiricilerin piyasaya sürülmesi, iyon değişim HPLC’nin uygulanmasını, 500 nükleotide kadar DNA sınırlama fragmanları gibi çok daha büyük moleküllere genişletmiştir.
Küçük oligonükleotidlerin ayrılması için anyon değişim, ters faz ve ters faz iyon çifti modlarının bir karşılaştırması, anyon değişiminin kolon ömrü daha kısa olabilse de en iyi çözünürlüğü sağladığı sonucuna varmıştır.
Ters Fazlı HPLC
Oligonükleotidlerin ters faz sabit fazlar üzerinde tutulmasına, nükleotid bazları ve durağan faz arasındaki hidrofobik etkileşimler hakimdir. Bu etkileşimler göreceli olarak spesifik nükleotid bazından bağımsız olduğundan, tutulma göreceli yük tarafından belirlenir ve daha yüksek yüklü moleküller önce ayrıştırılır.
Ters faz modu, ribo- ve deoksiribo-oligonükleotidlerin veya bunların 5′-fosforile türevlerinin ayrılması için kullanılmıştır. Tipik olarak, trietilamonyum asetat (pH 7.5) gibi zayıf bir sulu tampon içinde% 5 ila% 30 arasında bir asetonitril veya metanol gradyanı kullanılabilir.