Antinükleer Antikor (ANA)
Klinik uygulamada, indirekt immünofloresan ile gösterildiği gibi antinükleer antikorların (ANA) saptanması, SLE tanısı için tek ve en yararlı işarettir. ANA, bir insan epitel hücre hattından (HEp-2) türetilen kemirgen doku veya doku kültürü hücrelerinin test serumu ile kaplanması ve ardından floreseine konjuge edilmiş ikinci bir antikor olan anti-insan IgG'si ile saptanır.
Kemirgen dokusu kullanıldığında, aktif olarak tedavi edilmemiş hastalığı olan hastaların yaklaşık %95'inde yüksek titre ANA'sı vardır (>80'de 1). HEp-2 hücreleri, tedavi edilmemiş hastalığı olan hastalarda yaklaşık %98-99 pozitiflik ile daha da yüksek bir hassasiyet derecesi sergiler.
Amerikan Romatoloji Koleji, Amerikan Patologlar Koleji, Klinik İmmünoloji Derneği ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yakın tarihli yetkili kılavuzları, ANA taraması için en iyi substrat olarak HEp-2 hücrelerinin kullanılmasını önermektedir (Kavanaugh ve ark.). HEp-2 hücrelerinin yaygınlaşmasıyla birlikte tanısal bir varlık olarak ANA negatif lupusun varlığı sorgulanmaya başlanmıştır (Cross ve ark.).
Tersine, HEp-2 hücrelerinde ANA negatif olan bir hastada tedavi edilmemiş SLE olasılığı <%1 düzeyindedir. Bununla birlikte, pozitif bir ANA sonucu, çeşitli başka hastalıklarda ortaya çıktığı için SLE'ye özgü değildir.
HEp-2 hücrelerinde birkaç farklı ANA modeli tanınır: homojen, nükleolar, benekli, periferik ve sentromer. CREST sendromunun (kalsinozis, Raynaud fenomeni, özofagus disfonksiyonu, sklerodaktili, telenjiektazi) ve sklerodermanın spesifik bir belirteci olan sentromer antikoru dışında, diğer ANA paternlerinin hiçbiri antijenik özgünlüğün güvenilir bir göstergesi değildir.
Bu ve diğer birçok hastalık durumunda ANA oluşumu göz önüne alındığında, pozitif bir ANA'yı antijenik özgüllüğü açısından daha fazla karakterize etmek esastır. SLE'de dolaylı immünofloresan ile pozitif bir ANA, DNA, histonlar ve ayrı ayrı Ro, La, Sm ve U1-RNP (üridin ribonükleer) olarak bilinen bir grup ekstrakte edilebilir nükleer antijen (ENA) gibi nükleer antijenlere karşı antikorların varlığını yansıtır. protein).
Ekstrakte edilebilir nükleer antijenlere (ENA) karşı antikorlar
Ro, La ve Sm, ilk tanımlandıkları hastaların adlarını aldı: Robert, Lane ve Smith. U1-RNP (üridin ribonükleer protein) ile birlikte bu proteinler, mRNA'nın eklenmesinden ve işlenmesinden sorumludur. ANA'nın aksine, ENA'ya karşı antikorlar lupus ve ilgili bozukluklara özgüdür ve bu nedenle tanıda yardımcıdır.
Ek olarak, tek tek antikorlar belirli klinik belirtilerle korelasyon gösterme eğilimindedir; anti-Ro, lupus ve Sjögren sendromunda ortaya çıkar ve kutanöz hastalıkla koreledir. ANA yokluğunda anti-Ro antikorlarının oluşabileceğini bilmek önemlidir.
ANA-negatif, Ro-pozitif profil, lupuslu hastaların küçük bir kısmında (substrat olarak HEp-2 hücrelerinde <%1) oluşur; ancak kemirgen dokusu substratı üzerinde, Ro antijeni kemirgen dokusunda yetersiz temsil edildiğinden bu rakam %5'e yükselir.
ANA testi pozitif çıkanlar Kadınlar Kulübü
ANA testi pozitif çıkanlar
ANA testi pozitif doktorsitesi
Ana testi kaç günde çıkar
ana 1/100
Anti histon antikor
Nükleer patern ince benekli ne demek
Ana testi ekşi
Lupuslu gebe kadınların %5-25'inde, anti-Ro antikorları plasentayı geçerek yenidoğanda geçici kutanöz lupusa neden olur; daha ciddi olarak, anti-Ro pozitif annelerden doğan bebeklerin %1-3'ünde kalp pili takılmasını gerektiren kalıcı konjenital kalp bloğu gelişir.
Lupus hastalarının yaklaşık %30'unda anti-Ro antikorları izole olarak ortaya çıkarken, vakaların %15'inde bunlara anti-La antikorları eşlik eder. İkinci durumda, hastaların böbrek hastalığına sahip olma olasılığı daha düşüktür.
Yukarıda tartışılan klinik bağıntılara ek olarak, ANA negatif anti-Ro pozitif profili aynı zamanda erken kompleman bileşenlerini etkileyen altta yatan primer kompleman eksikliği için bir belirteç görevi görür. Homozigot C4 ve C2 eksiklikleri olan hastalarda yapılan araştırmalar, vakaların yaklaşık %50-70'inde anti-Ro pozitifliği ortaya koymaktadır.
SLE'nin primer kompleman eksikliği ile ilişkisinden sorumlu kesin mekanizma kurulmamış olsa da, eksik kompleman bileşeni ile ilgili olarak bir hastalık şiddeti hiyerarşisinin varlığı iyi belgelenmiştir; hastalık şiddeti C1q eksikliği olan hastalarda en fazladır ve bunu toplam C4 eksikliği yakından takip eder. C2 eksikliği olan hastalarda hastalık şiddeti, sağlam kompleman yolakları olan hastalarda görülenle karşılaştırılabilir.
Anti-Sm antikorları lupus için oldukça spesifiktir ancak prevalansları hastanın etnik geçmişine göre değişir; Afro-Karayipli hastaların %30'u, Kafkasyalıların %10'unun aksine anti-Sm- pozitiftir. Sm ve U1-RNP arasındaki paylaşılan peptit dizileri göz önüne alındığında, Sm ve U1-RNP'ye karşı antikorlar birlikte oluşma eğilimindedir.
İzolasyonda anti U1-RNP antikorlarının varlığının, ek polimiyozit ve skleroderma özellikleri olan lupus örtüşme sendromlu bir grup hastayı tanımladığı düşünülmüştür. Sharp ve meslektaşları, daha düşük böbrek ve nörolojik hastalık riski göz önüne alındığında daha iyi bir prognoza sahip oldukları düşünülen bu hastaları karakterize etmek için "karma bağ dokusu hastalığı" (MCTD) terimini ortaya attılar.
Orijinal kohortun uzun süreli takibi, birçok hastada daha sonra böbrek ve nörolojik hastalık geliştirdiğinden, MCTD'nin farklı bir benign antite olarak varlığını sorgulamıştır.
NOT: HEp-2 hücrelerinde antinükleer antikorların (ANA) boyama desenleri. (a) Homojen. (b) Benekli. (c) Nükleolar. (d) Çevresel. (e) Sentromer (23 çift kromozomun kinetokorlarının boyanmasını temsil eden çok sayıda ince noktanın görünümüne dikkat edin). Bay K. Taylor, Leeds General Revir'in izniyle
Algılama Yöntemleri
İmmünopresipitasyon tahlilleri ENA'ya karşı antikorlar birkaç yöntemle saptanabilir. Başlangıçta, birçok laboratuvar antikorların varlığını göstermek için karşı akım immünoelektroforezi (CIE) veya Ouchterlony çift difüzyon yöntemini kullandı.
CIE, agar jeller üzerinde gerçekleştirilir ve antikor ve antijenin, uygun pH'da immünopresipitasyonun meydana geldiği lamın merkezinde buluşmak üzere zıt yönlerde göç etmesine izin verir. Ouchterlony çift difüzyon tekniği de immünopresipitasyona dayalıdır; antijen, bir agar slaytının merkez kuyusuna yerleştirilirken, kontrol ve hasta serumu, merkezi kuyuyu çevreleyen kuyucuklara yerleştirilir. 24-48 saatlik inkübasyondan sonra, antijen-antikor reaksiyonunun varlığını gösteren presipitin çizgileri oluşur.
Presipitin kimliği, daha önce karakterize edilen referans serum tarafından üretilen presipitin çizgileri ile karşılaştırılarak belirlenir. Hem CIE hem de çift difüzyon, yüksek konsantrasyonlarda spesifik antikorları (0.1–1.0 mg/ml) tespit etmek için uygun kalitatif tekniklerdir.
Bazen çift difüzyon testlerinin sonuçlarını yorumlamak zor olabilir. Antijen konsantrasyonu, hasta serumundaki antikor konsantrasyonu ile bir denklik zonu oluşturacak şekilde ayarlanmazsa yanlış negatif sonuçlar oluşabilir ve özgünlüğü bilinmeyen çoklu çökelti çizgileri klinik olarak anlamlı antikorların tanımlanmasına müdahale edebilir.
Çift difüzyonun aksine, CIE nispeten daha yüksek hassasiyet, hız ve daha fazla numuneyi işleme yeteneği sergiler. Bununla birlikte, teknik olarak zahmetlidir ve sonuçları daha az nettir.
Diğer Belirteçler
Potansiyel yayılma belirteçlerinin istikrarlı bir akışı devam ediyor; bunların çoğu, hücre döngüsü sırasında yüksek ekspresyon seviyesine sahip proteinlere karşı geliştirilmiş antikorlardır. Ki67 ve PCNA’ya benzer bir şekilde, hücre döngüsünün belirli bir fazı veya fazları sırasında bir antijen mevcutsa, tespitinin, çoğalan hücreleri tanımlamak için kullanılabileceği anlamına geldiği varsayılmıştır.
Bu varsayılan markörler arasında, siklin ailesinin farklı üyeleri ve bunlarla ilişkili sikline bağımlı kinazlar (cdkler) ve retinoblastoma proteini (pRb) bulunmaktadır. DNA replikasyonu ile ilişkili diğer proteinler de, minikromo-bazı bakım proteinleri (Mcm) dahil olmak üzere potansiyel belirteçler olarak tanımlanmıştır. Bu Mcm proteinleri (bunlardan altı Mcm 2, 3, 4, 5, 6 ve 7) hem DNA replikasyonunun başlatılmasında hem de tek bir hücre döngüsünde yeniden replikasyonun önlenmesinde rol oynar.
Ne yazık ki, hücre döngüsüyle ilişkili bu markörlerin birçoğu, hücre döngüsünü kontrol eden proteinlerin düzenleyici yolundaki değişiklikler nedeniyle habis hücrelerde değiştirilmiş bir ekspresyona sahiptir ve proliferatif aktivitenin uygun markörleri değildir.
Hücre döngüsünü kontrol eden proteinlerin tanımlanmasındaki yüksek ilginin bir sonucu olarak, yeni antikorlar büyük bir hızla geliştirilmekte ve pazarlanmaktadır. Bu, çoğalma belirteçleri olarak potansiyellerinin tam olarak değerlendirilebileceği hızı aşıyor.
Sonuç olarak, herhangi bir yeni antikor kullanılırken, bir proliferasyon belirteci olarak kabul edilmeden önce yeterince doğrulanmış olduğundan emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Bununla birlikte, antikorların çoğu, proliferasyonu ölçmek için araçlardan ziyade spesifik biyolojik terapilere yönelik terapiyle ilişkili hedefler olarak ilgi çekicidir.
Moleküler markör teknikleri
Moleküler markörler Nedir
Moleküler ıslah nedir
Moleküler markörlerin kullanım alanları
Hızlandırılmış ıslah yöntemleri
Genetik markör Nedir
Markör gen nedir
Morfolojik markörler
İn situ hibridizasyon, proliferatif aktiviteyi göstermek için de kullanılmıştır. Histon 3 (H3) mRNA’nın ifadesi, birkaç yıldır böyle bir markör olarak kabul edilmiştir ve prognostik bilgi sağlayan diğer markörlerle iyi bir şekilde karşılaştırılır. Histonlar, kromatinin ana protein bileşenidir ve DNA ipliklerini kompakt bir formda, yani nükleozomda paketlemede rol oynarlar.
Histonlar DNA ile çok yakından ilişkili olduğundan, DNA sentezi sırasında da üretilmeleri gerekir. Bu nedenle, S-fazında artan H3 mRNA seviyelerinin tespiti, dokuların prolferatif aktivitesini yansıtır. H3 mRNA düzeylerinin G2 sırasında hızla düştüğü bilinmektedir ve hücre G0’a girdiğinde hiçbir sentez gerçekleşmez, bu da onu proliferatif aktivitenin en spesifik belirteçlerinden biri yapar.
Bununla birlikte, bu yöntem yaygın olarak kullanılmamaktadır, çünkü mRNA’yı tespit etmek için gereken yerinde hibridizasyon tekniği çoğu laboratuvarda hazır değildir; ayrıca sonuçlar, özel bir algılama yöntemi gerektirmeyen diğer markörlerden önemli ölçüde daha iyi değildir.
In situ hibridizasyon teknikleri ve özellikle izotopik olmayanlar giderek daha fazla laboratuvara tanıtılmaktadır, bu nedenle ileride belki de proliferatif bilgi H3 mRNA kullanılarak daha sık elde edilecektir.
Farklı proliferatif aktivite belirteçlerinin hem birbirleriyle hem de hücre döngüsünün farklı aşamalarıyla nasıl ilişkili olduğunu göstermektedir.
Markörlerin Pratik Kullanımı
Proliferatif aktiviteyi ölçme yönteminin seçimi, büyük ölçüde değerlendirilen materyalin türüne bağlıdır. Geriye dönük bir çalışma, parafine gömülü malzeme kullanılarak gerçekleştiriliyorsa, TLI, BrdULI ve mKi67 gibi yöntemler kullanılamaz.
Göz önünde bulundurulması gereken doku hazırlama noktaları, tüm belirteçleri etkilediği için kullanılan fiksatif tipini ve fiksasyonda bir gecikmenin neden olabileceği etkiyi içerir. Bazı alkol bazlı fiksatiflerde mitotik figürleri apoptotik cisimlerden ayırt etmek çok zordur; aynı şekilde, AgNOR’ların tanımlanması da zor olabilir.
Antijen ekspresyonu, ısı aracılı antijen geri kazanımının kullanılmasına rağmen bazı fiksatif solüsyonlarda azalır ve hatta kaybolur. Akış sitometrisinde bile nükleer boyalar, metal içeren bir fiksatif kullanıldığında kromatine bağlanamaz. Bazı çalışmalar, fiksasyondaki bir gecikmenin dokudaki mitoz sayısını azalttığını ve bu nedenle proliferatif aktiviteyi hafife alacağını göstermiştir.
Son olarak, kesit kalınlığının genellikle belirteçlerin gösterilmesi ve değerlendirilmesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu düşünülmez. Bununla birlikte, boyama kalitesini değiştirmenin yanı sıra, hem mitotik hem de AgNOR sayıları, kesitin kalınlığına göre değişecektir ve immünohistokimyada, sonuçta ortaya çıkan boyama yoğunluk olarak değişecektir.
Isı aracılı antijen geri alma aşamasından geçecek tüm bölümler yapışkan kaplı slaytlar üzerine konulmalı ve fırınlanmalıdır, aksi takdirde bölümler kalkar ve bazıları tamamen kopar.
Değerlendirme Yöntemi
En uygun proliferasyon belirteci seçildikten ve yöntem uygulandıktan sonra, sonraki soru şudur: Nasıl sayarım? ” Bu genellikle tüm tekniğin son ve en kolay aşaması olarak kabul edilir, ancak bir tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için metodik yaklaşım.
Binlerce hücre, numuneler arasında tatmin edici bir tutarlılık derecesi ile hızlı bir şekilde değerlendirilebildiğinden, akış sitometrisinin diğer işaretçilerden belirgin bir avantaja sahip olduğu bu aşamadadır. Bir histolojik bölümde bir proliferasyon belirtecinin gösterildiği diğer tüm yöntemler, karşılanması gereken bir dizi benzer kritere sahiptir.
İlk olarak, değerlendirmeyi gerçekleştirmek için geçen zaman, elde edilen bilginin değeriyle dengelenmelidir. Benzer prognostik bilgiler, bu sürenin bir kısmını alan yarı kantitatif bir yöntem kullanılarak elde edilebildiğinde, bir bölüm üzerinde resmi bir sayım yapmak için 20 dakika harcamak anlamsız olacaktır. İkinci olarak, hangi değerlendirme yöntemi kullanılırsa kullanılsın, hem güvenilir hem de tutarlı olmalıdır.
Burada tartışılan işaretçilerle kullanılan değerlendirme yöntemlerinin çoğu, geleneksel sayımlar veya tahminlerdir, ancak pazarda farklı özelliklere sahip görüntü analizine dayalı sistemlerin sayısı gittikçe artmaktadır.
Manuel yöntemler kullanılarak, değerlendirmeyle ilişkili öznelliği azaltmak için bir dizi kriterin karşılanması gerekir, böylece hem örnekler hem de değerlendiriciler arasında karşılaştırma yapılmasına izin verilir. Herhangi bir değerlendirmeye başlamadan önce aşağıdaki hususlar her zaman dikkate alınmalı ve çalışma süresince bunlardan sapılmamalıdır.
Bölümün hangi alanı değerlendirilmelidir?
Geleneksel olarak, bir tümörün ‘büyüyen kenarı’ değerlendirme için en uygun alan olarak kabul edilir. Bu, en proliferatif olma eğilimindedir ve genellikle histolojik derece için mitotik sayımın hesaplandığı alandır.
