CE-LIF TARAFINDAN KARBONHİDRAT ANALİZİ
Karbonhidratların rekombinant proteinlerin terapötik kullanımında anahtar bir rol oynadığı bilinmektedir. Son yıllarda, in vitro çalışmalar, temel efektör fonksiyonların, antikor molekülünün uygun glikosilasyonuna bağlı olduğunu kesin olarak ortaya koymuştur.
Bu nedenle glikosilasyon, biyofarmasötik endüstrisi için bir ilgi odağı olmuştur ve düzenleyici kurumlar, üretildikleri sistemden bağımsız olarak, rMAb’ler için tutarlı bir insan tipi glikosilasyonun sürdürülmesini gerektirir. Sonuç olarak, karbonhidratın hem yapısal karakterizasyonunu hem de rutin analizini gerçekleştirmek için yüksek performanslı analitik araçlar gereklidir.
Rutin profilleme ve kantitatif analiz çoğunlukla kromatografik ve düzlemsel elektroforetik tekniklerle gerçekleştirilir. Bunlar arasında en yaygın kullanılan teknikler, yüksek pH anyon değişim kromatografisi ve darbeli amperometrik tespit, kolon öncesi ve / veya sonrası türevleme şemaları ile sıvı kromatografisi ve florofor destekli karbonhidrat elektroforezidir.
Daha yakın zamanlarda, CE karbonhidrat analizinde güçlü bir araç olarak ortaya çıktı. Bununla birlikte, kromoforların kimyasal türevlendirme yoluyla karbonhidratlara kantitatif olarak eklenmesi, yalnızca absorpsiyon veya floresan detektörü kullanarak tespitini kolaylaştırmak için değil, aynı zamanda hidrofobiklik ve elektrik yükü gibi fiziksel özelliklerini değiştirmek için de gereklidir.
Bu nedenle, bir elektrik yükünün eklenmesi türevi elektroforetik ayırmaya yatkın hale getirir. Türevlendirme yöntemlerinin çoğu, reaktifteki amino grubunun ve indirgeyici karbonhidratta hemiasetal grubun reaktivitesini kullanan çeşitli aromatik veya heterosiklik aminlerle indirgeyici aminasyona dayanır.
Raporlar, 8-aminonaftalen-1,3,6-trisülfonik asit (ANTS), aminonaftalen sülfonik asitler ve 8-aminopiren-1,3-6-trisülfonik asit gibi floroforik etiketleme bileşiklerinin kullanımını içeriyordu. Kolon üzeri LIF, düşük nanomolar aralıkta bir algılama sınırı ile CE tarafından kullanılan en hassas algılama yöntemidir.
Biyoteknoloji endüstrisinde artan kabul gören karbonhidrat analizi için CE uygulamalarından biri, N-bağlı oligosakaritlerin rMAb’lerin Fc kısmı üzerinde korunmuş asparagin kalıntısı üzerindeki göreceli dağılımıdır. CE’nin geleneksel yöntemlere göre avantajları arasında artan ayırma verimliliği, daha kısa analiz süresi ve geliştirilmiş sağlamlık yer alır.
Bir monoklonal antikor üzerinde bulunan oligosakkaritler, Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücrelerinde üretilen yapıların tipik özelliği olan, çekirdek fukozlu asialo-N-bağlantılı kompleks iki antenli yapılardır.
Ana formlar fukosile dallı çekirdek yapısını paylaşır, ancak terminal galaktoz doluluklarında farklılık gösterir: (1) terminal galaktoz içermeyen sekiz şeker ünitesinden oluşan degalaktozillenmiş bir glikan (GO); (2) bir terminal galaktoz ile dokuz şeker birimi ve dolayısıyla iki konumsal izomer içeren kısmen galaktosile edilmiş bir glikan (G1); ve (3) her iki ucunda galaktoza sahip 10 şeker birimi içeren tamamen galaktosile edilmiş bir glikan (G2).
Hücre kültürü üretimi sırasında, tanımlanmış bir dizi ifade ve kültür koşulları altında bile oligosakaritlerin mikrohetero genliği gözlendi. İmalat tutarlılığını izlemek için, bu yakından ilişkili N-bağlantılı oligosakaritlerin göreceli dağılımını belirlemek için bir CE testi geliştirilmiştir.54 Bu yöntem üç adım içerir.
İlk olarak, oligosakaritler, oldukça spesifik bir endoglikosidaz, PNGase F ile rMAb’den enzimatik olarak çıkarılır. İkinci olarak, salınan oligosakaritler daha sonra indirgeme terminalinde APTS ile türevlendirilir. Son olarak, daha fazla saflaştırma olmaksızın, fazla reaktifleri ve APTS-oligosakarit eklentilerini içeren türevlendirme karışımı, basitçe su ile seyreltilir ve LIF tespiti ile CE ile analiz edilir.
Bir rMAb’nin N-bağlı oligosakkaritlerinin analizi için tipik bir elektroferogram Şekil 14’te gösterilmektedir. APTS-oligosakkarit eklentileri 3.0 ile 4.5 dakika arasında hareket eder. APTS-glikanlar yaklaşık olarak aynı net yükü taşıdıkları için, ayırma, görünür hidrodinamik boyutlarındaki farklılıklara dayanmaktadır. Bu nedenle, eklentiler artan boyut sırasına göre (GOoG1oG2) göç eder ve taban çizgisi çözülür.
Ayrıca, iki G1 konumsal izomeri de, G1 (a1,6) olarak ilk elüsyon zirvesi ile taban çizgisi çözünürlüğü ile ayrılır. İzomerlerin ayrılması, muhtemelen aynı net yüklere sahip oldukları için görünen hidrodinamik boyutlarındaki farklılıklara dayanmaktadır.
Diğer küçük tepeler, yüksek mannoz yapılarına karşılık gelir (yüksek mannoz 5 ve 6). Bu tahlil, ICH kılavuzlarına göre doğrulanmış ve bir ilaç maddesi salım testi olarak bu oligosakaritlerin göreceli dağılımının rutin izlenmesi için doğru, kesin ve uygun şekilde sağlam olduğu bulunmuştur.
Karbonhidrat tayin yöntemleri
Karbonhidrat analiz yöntemleri
Karbonhidrat tayini
Gıdalarda karbonhidrat tayini
Karbonhidratların analiz yöntemleri
Karbonhidratların Kalitatif Tayini
Benedict testi
Karbonhidratların analizi Nasıl yapılır
TERAPÖTİK PROTEİNLERİN CE VE KALİTE KONTROL TESTİ
CE’nin daha rutin uygulaması ve ticari reaktifler ve enstrümantasyonda yapılan ilerlemeler ile CE, kalite kontrol salım spesifikasyonları için uygun bir seçenek haline geldi. Spesifikasyonlar, ticari bir ilaç maddesi / ilaç ürününün salınmasının ayrılmaz bir parçasıdır.
Bir ilaç maddesinin, ilaç ürününün veya üretiminin diğer aşamalarındaki materyallerin, amaçlanan kullanımı için kabul edilebilir olarak kabul edilmesi gereken bir dizi kriter olarak tanımlanırlar. Spesifikasyonlar, uygun test prosedürüne ve ilgili kabul kriterlerine referanslarla birlikte bir test listesinden oluşur.
Spesifikasyonlar genellikle bir ilaç maddesinin / ürünün güvenliğini, kimliğini, saflığını ve bileşimini ölçmek için yöntemler içerir. SDS-PAGE ve IEF plaka jelleri tarihsel olarak biyo-farmakolojik kontrol spesifikasyonlarının bir parçası olmuştur, ancak son zamanlarda CE-SDS, cIEF ve CZE gibi CE yöntemleri biyoteknolojideki birçok uygulama için plaka jel formatının yerini almıştır. Önümüzdeki birkaç paragrafta, bazı yaygın CE yöntemlerini ve bunların bir kalite kontrol sistemindeki amaçlarını açıklayacağız.
Kalite Kontrol Uygulamaları
CE kalite salınım testinin iki ana kategorisine uygulanır: kimlik ve safsızlık testi. Tanımlama testleri, numunedeki bir analitin benzersiz kimliğini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu normal olarak numunenin bir özelliğinin (örneğin, spektrum, kromatografik davranış, kimyasal reaktivite, vb.) Bir referans standardınki ile karşılaştırılmasıyla elde edilir. Şekil 9’da gösterildiği gibi, CZE, benzersiz elektroforetik profillerine dayalı olarak monoklonal antikorların ve proteinlerin kimliğini belirlemek için kullanılabilir.
Saflık deneylerinin, numunenin safsızlık / saflık özelliklerini doğru bir şekilde yansıtması amaçlanır. Bu testler kantitatif veya limit bazlı olabilir. CE-SDS ve CE glikanı, saflık testleri olarak sınıflandırılır. Saflık açısından CE-SDS, SDS-PAGE için güvenilir bir alternatiftir ve SEC gibi diğer boyutlandırma yöntemlerine ortogonal bir yöntem olarak uygulanabilir. Geleneksel SEC ile karşılaştırıldığında CE-SDS, parçaların ayrılması avantajını sunar ve ayrıca proses safsızlıklarını kontrol etme imkanı sunar.
Bu nedenle, hem kantitatif ürünle ilgili saflık deneyi olarak hem de prosesle ilgili safsızlıklara göre bir sınır testi olarak doğrulanabilir. Spesifikasyonlar, ana pikin yüzdesine ve / veya yeni bir pikin tespitine göre ayarlanabilir.