Hangi anti-DNA testi seçilmeli?
İdeal tahlil, hastalık aktivitesini güvenilir bir şekilde yansıtmanın yanı sıra, lupus tanısı için yeterince duyarlı ve spesifik olmalıdır. Açıklanan üç testin tümü, aktif hastalığı olan hastalarda >%90 duyarlılıkla birinci kriteri karşılar. Özgüllük açısından, Crithidia ve Farr testleri (özgüllük >%90) ELISA'dan üstündür.
ELISA tahlillerinin, düşük aviditeli antikorları saptama eğilimleri nedeniyle, lupusu olmayan hastaların önemli bir azınlığında yanlış pozitif DNA antikoru sonuçları ürettiği bilinmektedir. Bu dezavantaja rağmen, ELISA tahlilleri, yüksek hassasiyetleri, otomasyon kolaylığı, sonuçları güvenilir bir şekilde nicelleştirme yetenekleri (seri izleme için faydalıdır) ve tahlilde radyoizotop eksikliği nedeniyle klinik uygulamada giderek daha fazla kullanılmaktadır.
Farr testi, hastalık izleme için eşit derecede uygundur ve özellikle böbrekleri içeren hastalık alevlenmelerinin gelişimini öngörmede gerçekten ELISA'dan üstün olabilir.
Yakın zamanda yapılan bir randomize Hollanda çalışmasında, immünosupresif tedavide önleyici artışlar alan anti-dsDNA seviyelerinde %25 artış olan hastalarda, konvansiyonel olarak tedavi edilen kontrol grubuna kıyasla nükslerde önemli bir azalma olmuştur (Bootsma ve ark.).
Lupus hastalarının küçük bir kısmı, DNA antikorlarında eşlik eden bir artış olmaksızın nüks edebilir; benzer şekilde, her üç testte de sürekli olarak yüksek antikor seviyeleri bulunmasına rağmen hastaların az bir kısmı klinik olarak stabil veya asemptomatik olabilir.
Lupus ve Antifosfolipid Sendromu
Fosfolipidlere (APA) karşı antikorlar, tromboz belirteçleri olarak işlev görür ve lupuslu hastaların üçte birinde görülür. 'Antifosfolipid sendromu' (APS) terimi, trombozu ve yüksek fosfolipid antikor seviyeleri olan hastaları tanımlamak için kullanılmıştır. Ağırlıklı olarak venöz trombozla sonuçlanan diğer trombofilik durumların aksine, APS'li hastalarda hem arteriyel hem de venöz damarlarda tromboz gelişebilir.
Klinik belirtiler, hangi organın iskemiye dönüştüğüne bağlıdır. APA, ELISA ile veya fosfo-lipid bağımlı pıhtılaşma tahlillerinin (aktive kısmi tromboplastin zamanı-APTT) uzatılmasıyla saptanabilir.
Asidik bir fosfolipid olan kardiyolipin kullanılarak antijen olarak ELISA ile saptanan APA, enfeksiyon (bakteriyel, viral, protozoal), ilaç tedavisi ve diğer bağ dokusu hastalıkları olan hastalarda birçok yanlış pozitif tanımlandığından, her zaman gerçek bir tromboz belirteci olarak hareket etmeyebilir. Aslında, geçmişteki yanlış pozitif VDRL, VDRL'de bulunan kardiyolipin'e yönelik APA'nın varlığından kaynaklanmaktadır.
Mevcut ELISA testlerinin trombozla ilişkili ve trombozla ilişkili olmayan APA arasında ayrım yapamaması, yüksek APA düzeylerinin klinik önemini yorumlamada zorluklara yol açmıştır.
Antifosfolipid sendromu belirtileri
antifosfolipid sendromu - ekşi
Antifosfolipid sendromu bitkisel tedavisi
Antifosfolipid sendromu gebelik
Sekonder antifosfolipid sendromu
Antifosfolipid sendromu Kadınlar Kulübü
Antifosfolipid sendromu laboratuvar
Antifosfolipid sendromu tanı kriterleri
Bu ayrım önemlidir, çünkü trombozla ilişkili APA'lı hastalar, muhtemelen ömür boyu yoğun, uzun süreli antikoagülan tedaviye ihtiyaç duyarlar. Son kanıtlar, trombozla ilişkili APA'nın, kendi başına fosfolipidlerden ziyade büyük ölçüde 2 glikoprotein I'e (2GPI, fosfolipitleri bağlayan bir serum protein ko-faktörü) yönelik olduğunu göstermektedir.
Mevcut tahlillerde iki 2GPI kaynağı bulunur: ELISA plakalarını bloke etmek için kullanılan insan serumu test numuneleri ve sığır serumu. 2GPI ile immobilize kardiyolipinin etkileşiminin, konformasyonunu değiştirerek immünojenik hale getirdiği düşünülmektedir.
Konvansiyonel ELISA tahlillerinin trombozla ilişkili ve trombozla ilişkili olmayan APA arasında ayrım yapamaması nedeniyle, antijen olarak saflaştırılmış 2GPI kullanan tahlillere büyük ilgi vardır. Varlıkları şu anda antifosfolipid sendromu için tanı kriterlerine dahil edilmemesine rağmen, anti-2GPI antikorları, ELISA ile saptanan geleneksel kardiyolipin antikorlarından daha güçlü tromboz öngörücüleridir.
Fosfolipid bağımlı pıhtılaşma deneylerine müdahale eden APA, bir fosfolipid-protrombin kompleksini tanır ve lupus hastalarında ortaya çıktıklarından dolayı lupus antikoagülanları (LAC) olarak adlandırılır. LAC terimi, kanamadan ziyade in vivo tromboz ile ilişkili olduğu için yanlış bir isimdir.
Normal plazmanın eklenmesiyle düzelmeyen uzamış bir APTT'den LAC'nin varlığından şüphelenilir, bu da bir inhibitörün varlığını düşündürür. LAC antikorlarının gösterilmesi, pıhtılaşmanın işlevsel düzensizliğini gösterdiğinden, bu antikorlar, ELISA tarafından gösterilen APA'ya göre tromboz ile daha yakından ilişkilidir.
Lupuslu hastaların çoğunda kardiyolipin antikorlarının yanı sıra LAC (%70) olacaktır, ancak hastaların az bir kısmında kardiyolipin antikorları veya LAC (her kategoride %15) olacaktır.
Nöropsikiyatrik sistemik lupus eritematozus (NPSLE)
Laboratuvar araştırmasının rolü
SLE'de nörolojik tutulum, hastalıklarının bir noktasında hastaların üçte ikisini etkileyen önemli bir sorundur. Bu tür hastaların yaklaşık %20'si bunu aktif sistemik hastalık zemininde yaparken, vakaların çoğunda sistemik hastalık sessizdir veya sadece hafif derecede aktiftir.
SLE ve nörolojik özellikleri olan bir hastayla karşı karşıya kalan hekim, doğrudan lupus (birincil) nedeniyle nörolojik hastalık, ikincil neden olarak fırsatçı enfeksiyon ve steroid psikozu arasında önemli bir ayrım yapmalıdır, çünkü çoğu hasta o sırada immünosupresif tedavide olacaktır. sunumun.
Altta yatan çok sayıda patojenik mekanizmayı yansıtan çok çeşitli klinik sunumlar görülmektedir. Çeşitli klinik sunumları açıklamak için en az üç hipotez öne sürülmüştür: anti-nöronal antikorlar, fosfolipid antikorlarla ilişkili tromboz ve sitokin kaynaklı hastalıktır.
Ne yazık ki, şu anda mevcut olan SLE laboratuvar belirteçlerinin hiçbiri birincil nörolojik lupus tanısı için yeterince spesifik değildir. Birkaç çalışma, serum veya beyin omurilik sıvısındaki (BOS) anti-DNA ve kompleman (C3, C4) düzeylerindeki anormalliklerin, SLE'de nörolojik ve nörolojik olmayan hastalık arasında ayrım yapmadığını göstermiştir.
Nöronlara (beyin dokusu ile çapraz reaksiyona giren lenfositotoksik antikorlar ve doğrudan nöronal antijenlere karşı hedeflenen antikorlar) karşı yönlendirilen antikorlar için başlangıçtaki istek, nörolojik tutulum olmayan lupus hastalarında varlıklarını gösteren çalışmalarla, nörolojik lupus için spesifik belirteçler olarak azaltılmıştır.
Aynı şekilde, ribozomal P proteinlerine karşı yönlendirilen antikorların, lupus psikozunun spesifik belirteçleri olduğu yönündeki son iddialar, psikozu olmayan SLE hastalarının %50'ye varan kısmında gösterilerek çürütülmüştür.
NPSLE gibi görünen enfeksiyon vakalarının teşhis edilebilmesi için tüm nöropsikiyatrik SLE hastalarında BOS muayenesi zorunludur. SLE'de nörolojik tutulumla ilgili yakın tarihli bir prospektif çalışmada, vakaların yaklaşık %50'sinde altta yatan neden enfeksiyon (kriptokok, tüberküloz ve piyojenik menenjit) olmuştur.
Yalnızca BOS'ta oligoklonal bantların varlığı birincil NPSLE'yi destekler ancak enfeksiyonla da ortaya çıkabilir. Spesifik bir laboratuvar belirtecinin yokluğunda, NPSLE tanısı büyük ölçüde geleneksel klinik sezgiye bağlı kalır.
KAPILLAR BÖLGE ELEKTROFOREZ
CZE’de proteinler, elektroforetik hareketliliklerindeki farklılıklara göre birbirinden ayrılır. Elektroforetik hareketlilik, bir proteinin moleküler yükünün ve hidrodinamik boyutunun bir fonksiyonudur. Belirli bir ortamda, elektroforetik hareketlilik, izoelektrik noktaya benzer şekilde proteinin kendine özgü bir özelliğidir.
Bu nedenle hareketlilik, proteinleri birbirinden ayırmak için kullanılabilir. Bu, nihai ürün ve ambalaj etiketlemesi için basit bir kimlik testi olarak CZE’yi kullanmanın temelidir. Örnek olarak, altı rMAb, bir rFab ve bir rF (abu) 2’nin CZE profilleri Şekil 9’da gösterilmektedir. Burada kullanılan proteinler, 7.5 ila 9.3 arasında değişen pI değerleri açısından benzerdir.
Ek olarak, rMAb’ler arasındaki amino asit sekansı homolojisi, rMAb 5 ve rMAb 5u arasında% 99 homoloji ile% 90’dan fazladır. Bu terapötik proteinlerin profilleri, protein yükü varyantları ile ilgili birçok pikin, bir genel koşul altında 15 dakikadan daha kısa bir sürede çözüldüğünü gösterir. Her molekül için ana pikin göç zamanlarının birbirinden açıkça farklı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ma ve Mire-Sluis’in belirttiği gibi, 40 bu benzersiz geçiş süresi, bir kimlik testi için gereken özgüllüğü sağlar.
CZE’nin yük heterojenliğini izleme potansiyeli, rMAb numunelerinin profillerinde gözlenen çeşitli zirvelerin daha fazla araştırılmasıyla incelenmiştir. RMAb 1 elektroferogramının genişletilmiş bir görünümü Şekil 10A’da gösterilmektedir. Karboksipeptidaz B sindirimi ile tedavi, üç ana zirvenin, ağır zincir üzerinde sıfır, bir ve iki C-terminal lizin41 kalıntısına sahip antikor formlarına karşılık geldiğini doğruladı.
Kullanılan CZE koşulları altında, antikor pozitif olarak yüklenir ve detektörü geçen katoda doğru hareket eder. Antikorun 2-Lys formu en yüksek sayıda net pozitif yüke sahiptir ve bu nedenle yüksek elektroforetik hareketliliği nedeniyle en hızlı şekilde yer değiştirir. Sonuç olarak, antikorun 1-Lys ve 0-Lys formları, azalan hareketlilik sırasına göre yer değiştirir. Ek olarak, daha düşük elektroforetik hareketliliğe sahip antikorun asidik varyantlarının 0-Lys zirvesinden sonra göç ettiği gözlendi.
CZE, yük heterojenliğinin analizi için potansiyel bir tamamlayıcı araç olarak yaygın olarak kullanılan iyon değişim kromatografisi (IEC) tekniği ile karşılaştırılır. RMAb 1’in IEC analizinden elde edilen tipik bir kromatogram Şekil 10B’de gösterilmektedir. CZE’ye benzer şekilde, üç ana tür, ağır zincirde sıfır, bir ve iki C-terminal tortusu olan antikor formlarıydı. Bu durumda, elüsyon sırası, ilk olarak 0-Lys türlerinin ayrıştırıldığı CZE’dekine zıttı çünkü bu üç form arasında en asidik türdü; bu nedenle, katyon değişim kolonunun negatif yüzeyi ile en zayıf etkileşime sahipti.
Asidik varyantlar, 0-Lys pikinden önce yıkanarak da gözlendi. Rekombinant antikorların yük heterojenliğini izlemek için CZE yönteminin avantajları, hızlı analiz sürelerinde birden fazla ürünü analiz etmek için bir jenerik CZE koşulunu kullanma olasılığını içerir. Bu, hücre kültürü sırasında üretilen rMAb numunelerinin yüksek verimli analizini ve proses geliştirmenin saflaştırma çabalarını karşılamak için önemli bir özelliktir.
CZE, terapötik rMAb’lerin formülasyon geliştirilmesinde ve stabilitesinin izlenmesinde pratik bir teknik olarak da kullanılabilir. Tahlilin, çeşitli zorunlu bozunma koşullarına maruz kalan rMAb numunelerindeki değişiklikleri tespit etme yeteneği değerlendirildi. Çeşitli koşullar altında zorla bozulmuş örneklerin temsili CZE profilleri Şekil 11’de gösterilmektedir. Bu sonuçlar, testin bir kontrol rMAb örneğinin yük heterojenliği profilindeki değişiklikleri saptayabildiğini gösterdi.
Amino asitlerde izoelektrik nokta nedir
Glisin titrasyon eğrisi
Biüret deneyi raporu
İzoelektrik nokta hesaplama
Biüret Deneyi prensibi
Ksantoprotein deneyi
Ninhidrin reaksiyonu
Amino asitlerin titrasyon eğrisi
KAPILLAR ISOELEKTRİK ODAKLAMA
Terapötik proteinlerin proses gelişimi ve analitik karakterizasyonu, bu biyoteknoloji ürünleriyle ilişkili karmaşıklık ve heterojenlik nedeniyle birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Daha önce, terapötik rMAb’ler kalitatif, emek yoğun jel IEF yöntemleri kullanılarak karakterize ediliyordu. Kapiler izoelektrik odaklama (cIEF), geleneksel jel IEF’in yüksek çözme gücünü CE enstrümantasyonunun avantajı ile birleştirir.
Proteinler, kılcal damarlara bir elektrik alanı uygulandığında taşıyıcı amfoliitler tarafından oluşturulan bir pH gradyanında izoelektrik noktalarına (pI) göre ayrılır. Bir proteinin pl’si (proteinin net sıfır yüke sahip olduğu pH), amino asit bileşimi, dizisi, 3-D yapısı, çeviri sonrası modifikasyonları vb. İle tanımlanır.
CIEF’te genellikle LIF ve UV gibi çevrimiçi konsantrasyona duyarlı dedektörler kullanılır. Çoğu ticari CE cihazındaki dedektör, kılcalın çıkışına doğru sabit bir noktadadır. Sonuç olarak, kılcal damar içindeki odaklanmış protein bölgeleri, detektör penceresinden geçmek için harekete geçirilmelidir.
İsoelektrik Noktasının Belirlenmesi
CIEF’in önemli bir uygulaması, bir proteinin izoelektrik noktasının belirlenmesidir. Klasik IEF’de olduğu gibi, cIEF yöntemi, pI’leri bilinen standart işaretleyicilerle kalibrasyonu içerir. CIEF’de yaygın olarak kullanılan belirteçler, geleneksel protein standartlarına kıyasla büyük stabilite ve algılama hassasiyeti olan sentetik düşük moleküler ağırlıklı bileşiklerdir.
Bilinmeyen izoelektrik noktası ve pl markörleri olan bir rMAb’nin tipik cIEF profilleri Şekil 12’de gösterilmektedir. Ağır zincirlerin karboksil terminalinde sıfır, bir ve iki lizin kalıntısına sahip üç antikor formunu temsil eden üç ana tepe gözlendi.
PI’ye karşı mobilizasyon süresinin bir grafiği, tanımlanmış bir pH aralığında doğrusallık göstermelidir. Böyle bir kalibrasyon grafiği Şekil 13’te gösterilmektedir ve görünen pl değerleri, pI’lerinin belirlenmesi için sırasıyla 0-Lys, 1-Lys ve 2-Lys antikor formları için 9.0, 9.1 ve 9.2 olarak hesaplanmıştır. bir rMAb’nin bileşenleri.
RMAb Şarj Heterojenliğinin İzlenmesi
CIEF’in genel rMAb yük dağılımını değerlendirme potansiyeli Şekil 13’te gösterilmektedir. Elektroferogram, pI markörleri 7.9 ve 5.3 arasındaki antikorun çeşitli izoformlarını gösterir. Antikorun ana zirvesi veya 0-Lys formu B27 dakikada görünür. Ağır zincirde bir ve iki C-terminal Lys kalıntısına sahip daha temel türler, birbirlerinden ve ana pikten temelde ayrıştırılır.
Sonuçları, Şekil 10’da gösterildiği gibi CZE ve IEC tarafından elde edilenlere benzerdir. Öte yandan, asidik varyantlar, Şekil 13’te gösterildiği gibi, cIEF tarafından 0-Lys formundan daha iyi ayrılır. Şekil 10. Birlikte ele alındığında bu veriler, terapötik proteinlerin yük heterojenliğini izlemek için IEC ile tamamlayıcı bir teknik olarak cIEF’i kullanmanın uygulanabilirliğini gösterir.