HbF Ölçümü
HbF, normal yetişkinlerde < %1’i oluşturur ve talasemi taşıyıcılarının yaklaşık yarısında hafifçe yükselir. HPFH ve -talaseminin her ikisi de önemli ölçüde yüksek HbF seviyelerine yol açar ve sırasıyla azalmış MCV ve MCH’nin aksine normal ile ayırt edilir.
Bazı HPFH türleri “panselüler” (RBC’lerde HbF’nin eşit dağılımı ile), diğerleri ise “heteroselüler” (RBC’lerde HbF’nin heterojen dağılımı ile) olduğundan Kleihauer testi de yararlı olabilir. Talasemide dağılım tipik olarak heterosellülerdir. Ancak, özellikle -talasemi düşük MCV’ye neden olan olası bir birliktelik durumuysa, bu ayrımdan emin olmak için DNA analizi yapılması gerekebilir.
HbF testi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem ilk olarak Betke tarafından ortaya atılmıştır ve dirençli olan bozulmamış HbF’yi bırakarak diğer hemoglobinlerin alkali ile seçici denatürasyonuna dayanmaktadır. Seyreltik bir lizat çözeltisi, diğer tüm fraksiyonları oksitleyen NaOH ile 2 dakikalık sabit bir inkübasyona tabi tutulur.
Elde edilen metaemoglobinler, oksidasyonu da nötralize eden doymuş bir tuz çözeltisi ile çökeltilir. Çözelti içinde kalan HbF, süzme yoluyla veya tercihen yüksek hızlı santrifüjleme ile çökeltiden ayrılabilir. HbF fraksiyonunun oranı, toplam Hb seyreltmesine karşı optik dansitometri ile belirlenir.
< %1’lik bir HbF düzeyi yetişkin normal aralığını oluşturur; %1-5, -talasemi taşıyıcılarının %50’ye kadarında bulunur; %5-20’si -talasemi özelliğinin ve bazı HPFH vakalarının karakteristiğidir; %20–45, pansellüler Afrika tipi HPFH’nin karakteristiğidir. Bazı homozigot durumlarda HbF, toplam Hb’nin > %90’ını temsil edebilir.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)
HPLC, hemoglobinlerin saptanmasını, tanımlanmasını ve miktarını tek bir teknikte birleştirir ve çok sayıda örneğin hızlı, doğru ve ucuz bir şekilde taranması için son derece uygundur.
Reçinenin bir poliaspartat yan zinciri olmasına, yani bir katyon değiştirici olmasına ve sıvı fazın bir Cl iyon olmasına rağmen, ayırma ilkesi mikrokolon kromatografisininkiyle aynı kalır. Analiz, kolona bir otomatik örnekleyici enjeksiyonu ve lizatın üstüne sabit bir elüsyon tamponu basıncı uygulayan bir pompa ile otomatikleştirilir.
Bu, elüsyon süresini kontrol eder ve düzenler. Ayırma hassasiyeti, iyon konsantrasyonu ve/veya pH açısından farklılık gösteren iki tamponun kullanılmasıyla büyük ölçüde artırılır. Hb fraksiyonları, iki sıvı fazın karıştırılmasıyla elde edilen bir elüsyon gradyanı yaratılarak kolondan sırayla ayrıştırılır.
Bu, daha önce çözülmemiş varyantların, yani D’nin G’den ve E’nin O’dan ayrılmasını sağlar. Eluatların optik yoğunluğu, kolondan geçerken doğrudan ölçülür ve bir kromatogram oluşturmak için sürekli olarak çizilir.
Tanımlama, alıkonma sürelerinin bilinen varyantlarınkiyle karşılaştırılmasıyla sağlanır. Hem ana hem de küçük bileşenler, her bir tepe noktasının altındaki alanı entegre ederek doğru bir şekilde nicelendirilebilir; ve -talasemiler, HbA2 seviyesi otomatik olarak hesaplandığından kolaylıkla ayırt edilir.
HPLC tarafından saptanan bir Hb varyantının kimliğinin ikinci bir teknikle (örneğin elektroforez veya orak çözünürlüğü) doğrulanması tavsiye edilir.
İnklüzyon cisimcikleri
Sitoplazmik inklüzyonlar Nedir
Cowdry A inklüzyon cisimciği
Hücrenin sitoplazmik inklüzyonları nelerdir
İnklüzyon cisimcikleri nelerdir
İnklüzyon cisimciği oluşturan virüsler
İnklüzyon örnekleri
Hücrede bulunan inklüzyonlar
RBC İnklüzyon Cisimlerinin Tespiti
Supravital boyaların redoks reaksiyonu, Hb türevlerinden oluşan kırmızı hücre inklüzyon cisimlerini boyamak için kullanılabilir. Bu özellik, Hb bozukluklarının daha ileri karakterizasyonunda faydalıdır.
HbH, -talasemide aşırı zincirlerden (4) oluşan bir tetramerdir ve önemli miktarlarda mevcut olduğunda (yani HbH hastalığında) elektroforez veya HPLC ile saptanabilir. Hücre içi HbH çözünür ancak çok kararsızdır ve parlak kresil mavisi ile inkübasyon yoluyla çökeltilir.
Çökelti, RBC’lere çok sayıda lekeli gövde ile tipik bir ‘golf topu’ görünümü vermek için RBC zarına yapışır. HbH inklüzyonları -talasemi özelliğinde 1-2 hücre/1000’de mevcuttur, ancak mikroskobik olarak tespit edilmesi zor olabilir. HbH hastalığında çok daha fazla sayıda ve belirgindirler.
Heinz cisimleri (kararsız hemoglobinler) standart bir Romanowsky lekeli film üzerinde görünmez, ancak metil menekşe ile inkübasyonun ardından büyük, yuvarlak ve genellikle tek hücre içi çökeltiler olarak saptanabilir.
Varlıkları genellikle sadece akut hemolizde saptanır ve dalak fonksiyonu sağlamsa veya leke çok taze kanda yapılırsa belirgin olmayabilir.
Kararsız Hemoglobinlerin Tespiti
Hb’nin moleküler kararsızlığı, hem bağlama gruplarında, temas alanlarında veya hem cebinin iç kısmındaki amino asit ikamesinden kaynaklanabilir. Bu kusurlar, hem-globin temaslarında ve genel tetramerik veya sarmal yapılarda zayıflık sağlar.
Bu, hem demirin geri dönüşümsüz oksidasyonuna ve Hb’nin Heinz cisimleri şeklinde hücre içi çökelmesine eğilim ile fizyolojik strese karşı toleransın azalmasına yol açar. Bazıları konjenital Heinz vücut hemolitik anemilerine yol açan 180’den fazla bilinen kararsız hemoglobin vardır ve bunların şiddeti moleküler kusurun doğasına ve konumuna bağlı olarak değişir.
Elektroforez, kararsız Hb hastalığının tanısında özellikle yardımcı olmayabilir, çünkü bu mutasyonların çoğu molekülün net yükünde hiçbir değişiklik göstermez. Kararsızlık, bir çözücüye maruz kalmaya veya ısı ile çökelmeye dayalı olarak iki denatürasyon ekranı kullanılarak tespit edilir.
Numuneler taze olmalıdır ve pozitif kontrol olarak bir kordon kanı kullanılabilir (HbF, normal yetişkin Hb’ye kıyasla ısıya ve hidrofobik strese nispi bir intoleransa sahiptir).
Isı Kararsızlığı Testi
Bu tarama, hemoglobini 50 C’de inkübasyona tabi tutar, bu da zaten zayıflamış dahili van der Waals bağları üzerinde daha fazla baskı uygulayarak alt birimlerin normalden daha kolay ayrışmasına neden olur.
İzopropanol stabilite testi
İzopropanol ile inkübasyon hidrofobik stresi indükler. İzopropanol sudan daha polardır ve hidrofobik bağları zayıflatır, suyun hem cebine girmesine izin verir ve hem demirin oksidasyonunu kolaylaştırır.
Her iki ekranda da normal hemoglobin çözelti içinde kalırken, değişken flokülasyon ve çökelme ile kararsız varyantlar tespit edilir.
Moleküler analiz
Yukarıda açıklanan standart tarama teknikleri, yaygın mutasyonların tespiti ve karakterizasyonu için yeterlidir, ancak nadir varyantların tanımlanması ve talasemi kusurlarının spesifik tanımında sınırlıdır.
Kesin moleküler lezyonun tanımlanması, genetik danışmanlık, doğum öncesi tanı ve bazen klinik yönetim amaçları için esastır. Bu, periferik kan lökositlerinden veya prenatal tanı için koryonik villus örneklerinden (CVS) ekstrakte edilen ve amplifiye edilen genomik DNA’nın analizi ile elde edilir.
DNA analizi için tanı tekniklerinin geliştirilmesinde son zamanlarda hızlı ilerleme kaydedilmiştir. Bunların ve uygulamalarının ayrıntılı bir açıklaması bu bölümün kapsamı dışındadır. Ancak polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) hemoglobinopati tanısında kullanımına ilişkin kısa bir özet verilmiştir.