Enzim immünolojik testleri
Daha yakın zamanlarda, ENA’ya karşı antikorları tespit etmek için sandviç immünolojik testler geliştirilmiştir. Kısaca yöntem, antikor içeren hastanın serumunun, saflaştırılmış veya rekombinant bireysel ENA ile kaplanmış mikrotitre plaka kuyularına eklenmesini içerir. Antijene bağlanan antikorlar, bir enzim veya lüminesan molekül ile konjuge edilmiş bir poliklonal veya monoklonal anti-insan immünoglobulin antikorunun eklenmesiyle tespit edilir.
Hasta serumundaki antikor konsantrasyonu, renkli veya floresan ürünün yoğunluğu ile doğrudan ilişkilidir. Enzim immünolojik testleri, CIE veya çift difüzyondan daha duyarlıdır (analitik duyarlılık 1-10 ng/ml). Sonuç olarak, artan non-spesifik bağlanmanın bir sonucu olarak hipergamaglobulinemik serumlarda yanlış pozitif sonuçlar meydana gelebilir.
İmmünoblotlama
ENA’ya karşı antikorların saptanması için ek bir yöntem, nitel immünoblotlama tekniğidir (Western blot). Kısaca, bir nükleer özütten elde edilen antijenler, moleküler ağırlığa göre sodyum dodesil sülfat elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılır.
Ayrılan antijenler daha sonra tek şeritler halinde kesilen ve hasta serumu ile inkübe edilen nitroselüloz kağıdına aktarılır (blotlama) (ayrı antijenlerle önceden kaplanmış ticari şeritler de mevcuttur). Bağlı antikorlar, şeritlerin enzim etiketli bir anti-insan immünoglobulin ile inkübe edilmesiyle saptanır.
Arthritis Foundation ve ABD Hastalık Kontrol Merkezleri tarafından yakın zamanda yürütülen bir kalite kontrol çalışmasında, önceden immünofloresan ve çift difüzyon ile karakterize edilen referans serumlarda anti-ENA özgüllüklerini yeniden analiz etmek için immünoblotlama kullanıldı.
Blotting nedir
Southern blot
Moleküler yöntemler
Southern blot yöntemi
Western blot nerelerde kullanılır
Moleküler Biyoloji Teknikleri
Transfeksiyon yöntemleri
Moleküler genetik yöntemleri nelerdir
İmmünoblotlamanın sonuçları, büyük ölçüde çift difüzyonla uyumluydu, ancak ek belirtilmemiş bantların raporlanmasıyla ilgili olarak bireysel laboratuvarlarda farklılıklar kaydedildi. Bu, bireysel laboratuvarlar tarafından kullanılan tekniklerdeki küçük farklılıklar nedeniyle immünoblotlama ile tanınan bir olgudur. İmmünoblotlama şu anda klinik immünoloji laboratuvarlarında rutin olarak kullanılmamaktadır.
Spesifikliği göz önüne alındığında, standart tahlillerle tutarsız sonuçlar veren hasta numunelerinin araştırılması için ayrılma eğilimindedir. Konvansiyonel analizlerin DNA ve ENA’ya karşı antikorları tespit edemediği, lupus veya lupus örtüşme bozukluklarının zorlayıcı klinik kanıtı olan bu nadir hastalarda, immünoblotlama, önceden karakterize edilmemiş antijenlere karşı antikorları tespit etme potansiyeli sunar.
NOT: İmmünoblotlamada ekstrakte edilebilir nükleer antijenlere karşı klasik antikor profilleri. Biodiagnostics Ltd.’nin izniyle değiştirilmiştir. SS-A ve SS-B, sırasıyla anti-Ro, La antikorları için alternatif terimlerdir. P1 ve P2, Ro’nun ayrı alt birimlerini ifade eder. Dahil edilen ilave antikorlar, anti-Scl 70 (skleroderma için belirteç), anti-Jo1 (interstisyel akciğer hastalığı olan polimiyozit belirteci), anti-PCNA (prolifere olan hücre nükleer antijeni; SLE vakalarının %2-10’unda görülür)
Çift sarmallı DNA’ya karşı antikorlar (anti-dsDNA)
Çift sarmallı DNA’ya (anti-dsDNA) karşı yönlendirilen antikorlar, özellikle böbrekte olmak üzere SLE’deki organ hasarının patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Böbrek biyopsilerinin eluatlarında dsDNA ve IgG anti-DNA antikorlarının kompleksleri gösterilmiştir. Bu bulguya uygun olarak, anti-dsDNA antikorlarının seviyeleri SLE’deki genel hastalık aktivitesi ile iyi korelasyon gösterme eğilimindedir.
Çoğu hastada, serumdaki anti-dsDNA seviyelerindeki bir artış, bir hastalık alevlenmesinin habercisidir. Bazen, daha önce yükselmiş olan anti-dsDNA seviyelerindeki bir düşüş, muhtemelen böbrekte immün kompleks birikiminin bir yansıması olan lupus nefritinin habercisi olabilir.
dsDNA’ya karşı antikorlar, tedavi edilmemiş hastalığı olan hastaların %75-95’inde meydana gelen SLE için oldukça spesifik iken, tek sarmallı DNA’ya (ssDNA) karşı antikorlar spesifik değildir ve çeşitli başka hastalıklarda (romatoid artrit, kronik aktif hepatit, sağlıklı yaşlılar) lupusa ek olarak.
Algılama Yöntemleri
Anti-dsDNA’yı saptamak için mevcut birçok yöntemden çoğu klinik immünoloji laboratuvarı aşağıdaki üç testten birini kullanacaktır.
Farr tahlili
Farr tahlili, antijen olarak radyo-etiketli dsDNA’nın (125I yaygın olarak radyoizotop olarak kullanılır) kullanımını kullanır. 125I-dsDNA ile anti-dsDNA içeren test serumunun kuluçkalanması, doymuş bir amonyum sülfat çözeltisi kullanılarak çökeltilen bağışıklık komplekslerinin oluşumuna yol açar.
Anti-dsDNA miktarı, çökeltideki radyoaktivite miktarı ile doğru orantılıdır. Test numunelerindeki anti-dsDNA konsantrasyonu, bilinen miktarlarda antikor içeren bir referans standart serum varlığında 125I etiketli DNA miktarının ölçülmesiyle elde edilir.
Test standardizasyonu için Wo/80 olarak adlandırılan bir WHO standart serumu mevcuttur. Amonyum sülfat, düşük aviditeye sahip antikorlar içeren immün kompleksleri bozduğundan, Farr testi ağırlıklı olarak böbrek hastalığı ile ilişkili şiddetli lupus varlığı ile iyi korelasyon gösteren yüksek aviditeli antikorları saptar. Ancak Farr testi, nispeten hafif lupuslu hastalarda ortaya çıkan düşük aviditeli anti-dsDNA antikorlarını saptamaz.
ELISA
DNA antikorlarının saptanması için saflaştırılmış dsDNA’yı (rekombinant veya buzağı timus özünden) kullanan bir dizi ticari ELISA tahlili mevcuttur. dsDNA doğrudan plastik kuyulara bağlanmadığından, çoğu tahlil, mikrotitre plakalarını kaplamak için poli-L-lizin veya protamin ile komplekslenmiş DNA kullanır. Farr testinin aksine, ELISA testleri hem düşük hem de yüksek aviditeli DNA antikorlarını tespit eder.
Sonuç olarak, ELISA tahlili, teşhis amaçları için Farr tahlilinden daha yüksek bir hassasiyet derecesi sergiler; bununla birlikte, göreceli olarak daha düşük özgüllüğü, lupusu olmayan hastalarda önemli sayıda yanlış pozitif DNA antikor sonucunun üretilmesiyle sonuçlanır, örn. enfeksiyonlar, kronik karaciğer hastalığı.
Dolaylı immünofloresan kullanma
Crithidia luciliae Hemoflagellat Crithidia luciliae’nin büyük mitokondrisi (kinetoplast) neredeyse tamamen çift sarmallı DNA’dan oluştuğu için, Crithidia’yı antijen olarak kullanan dolaylı immünofloresan çalışmaları, anti-DNA antikorlarının saptanması için yüksek derecede duyarlılık ve özgüllük sergiler.
Sabit C. luciliae içeren ticari slaytlar, uygun şekilde seyreltilmiş test serumu ile inkübe edilir, ardından floreseine konjuge anti-insan immünoglobulin antikoru eklenir. Kinetoplastla sınırlı floresan üreten numuneler pozitif olarak kabul edilir.
Ara sıra numuneler de nükleer floresan üretebilir, ancak çekirdek DNA’ya ek olarak birçok başka antijen içerdiğinden bu göz ardı edilmelidir. Bazı çalışanlar, kinetoplastın histonlar (DNA’ya bağlanan temel proteinler) içerebileceği ve anti-histon antikor pozitif serumda yanlış pozitif sonuçlara yol açabileceği endişesini dile getirse de, bu doğrulanmamıştır.
Histonlarla kontaminasyonun bir endişe kaynağı olduğu çoğu durumda, histonları ortadan kaldıran bir prosedür olan hidroklorik asit ile ön işleme tabi tutulmuş Crithidia lamlarında immünofloresan yapmak mümkündür. İmmünofloresan testlerin standardizasyonu ile ilgili zorluklar göz önüne alındığında, Crithidia testi antikor seviyelerinin seri izlenmesi için güvenilir değildir.