BİYOKİMYA VE MOLEKÜLER BİYOLOJİDE
LABORATUVAR TEKNİKLERİ
HPLC Teorisi
Sıvı kromatografi, bir bileşen karışımının bir kromatografik kolondan geçerek bileşen parçalarına ayrıştırıldığı bir ayırma yöntemidir. Bileşenlerin karışımını içeren hareketli fazın katı partiküllerle dolu bir kolondan oluşan durağan fazdan geçirilmesi ile gerçekleştirilir.
Çözünen maddeler ve iki faz arasında etkiyen fiziksel ve kimyasal kuvvetler, çözünen maddelerin kromatografik sütun üzerinde tutulmasından sorumludur. Bireysel çözünen maddelerin çözünürlüğünü ve dolayısıyla ayrılmasını belirleyen, bu kuvvetlerin büyüklüğündeki farklılıklardır. Alternatif olarak, ayrışmanın, iki faz arasında çözünen maddelerin dağılımı ile belirlendiği düşünülebilir.
Moleküllere etki eden temel kuvvetler beş türdendir:
- (1) London dağılım kuvvetleri veya van der Wads kuvvetleri moleküller arasında işleyerek elektrostatik konfigürasyonlarının anlık bozulmasına neden olur.
- (2) Dipol etkileşimleri geçici olarak bozulan moleküllerde ortaya çıkar ve moleküller arasında elektrostatik çekim ile sonuçlanır.
- (3) Hidrojen bağ etkileşimleri proton vericiler ve proton alıcıları arasında meydana gelir.
- (4) Çözünen moleküller ve yüksek dielektrik sabitli bir çözücü arasındaki elektrostatik çekimden kaynaklanan dielektrik etkileşimler.
- (5) Elektrostatik veya kulombik etkileşimler.
Bu moleküller arası kuvvetleri etkileyen herhangi bir değişken, kromatografik kolondan geçerek elde edilen ayrılma derecesini etkileyecektir.
Tam bir kromatografi teorisi geliştirmek zordur çünkü esasen denge dışı bir süreçtir ve çözücü akışı genellikle hareketli ve sabit fazlar arasında çözünen moleküllerin dengesine izin vermek için çok hızlıdır. Böyle olmasaydı, basit difüzyon, bant yayılmasına ve dolayısıyla zayıf ayrılmaya yol açan önemli bir faktör olurdu.
HPLC sonuç değerlendirme
yüksek performanslı sıvı kromatografisi (hplc)
HPLC pik yorumlama
HPLC çalışma prensibi
HPLC analizleri
HPLC kolon seçimi
HPLC PDF
Hplc Nedir
Ek olarak, bir kolon boyunca çözücü akışının modellenmesi kolay değildir çünkü bu, sabit faz partiküllerinin şekline ve bunların birlikte paketlenme şekline bağlıdır; ayrıca çözücü akımında üretilen sonuçta ortaya çıkan girdaplar teorik problemler ortaya çıkarır. Ulaşmayı umabileceğimiz en iyi şey, tüm kromatografik kolonun ortalamasını tanımlayan bir teoridir.
İyileştirilmiş çözünürlük için, (a) moleküler difüzyonu artırarak veya moleküllerin yayılması gereken mesafeyi azaltarak ve (b) sabit fazın düzgün bir şekilde paketlenmesini sağlayarak akış modelinde iyileştirmeler yaparak daha iyi dengeleme oranları hedeflenmelidir.
Bileşiklerin HPLC ile ayrılması ve saflaştırılması, teorik değerlendirmelerle birbiriyle ilişkilendirilebilen bir dizi fiziksel parametreye dayanır. Başarılı HPLC ayrımlarını gerçekleştirmek için, HPLC’nin pratik kullanımında ortaya çıkabilecek sorunların üstesinden gelmek için bu parametrelerin ve bunların karşılıklı ilişkisinin makul bir şekilde anlaşılması önemlidir.
İlk olarak, verimli ayırmalar yapmak için, “iyi” ve “kötü” sütun arasındaki farkı neyin oluşturduğunun anlaşılması gerekir. Bir bileşenin “iyi” bir sütundan elüsyonu, orijinal numune konsantrasyonundan minimum seyreltmeyi temsil eden keskin, dar bir bant olarak gerçekleşir.
Tersine, “kötü” bir sütun önemli ölçüde seyrelmeye neden olarak geniş bir bandın elüsyonuna ve dolayısıyla farklı bileşenler arasında çok az çözünürlüğe neden olacaktır.
Genel kromatografik sistemin kalitesini belirleyen sadece durağan faz ve bunun kolon içindeki paketlenmesi değildir.
Örneğin, valfler, tüpler ve detektör mobil fazın gereksiz şekilde büyük hacimlerini tutabilir; benzer şekilde, kolon uç parçası tasarımı eşit bir sıvı dağılımı oluşturmayabilir; bu parametrelerden herhangi biri önemli ölçüde bant genişlemesine neden olabilir.
Temel kurallar
Kromatografik teoriyi daha ayrıntılı olarak ele almadan önce, temel parametreleri anlamak önemlidir. Zamana veya hacme karşı çizilen bir kolondan (bir numune detektörünün tepkisi ile belirlendiği üzere) çözünen elüsyon konsantrasyonunu temsil eden tipik bir kromatogramı gösterir.
Numunenin kolona enjekte edilmesinden sonra, durağan faz ile etkileşmeyen bileşikler, zaman zaman boşluk hacmi V, içine taşınacaktır. Boş hacim, durağan fazın parçacıkları ile parçacık gözenekleri içindeki erişilebilir hacim arasındaki ara hacmin toplamını temsil eder.
Numunenin alıkonma süresi (t,) enjeksiyondan ayrıştırılan pikteki maksimum konsantrasyona kadar geçen süredir. Tutma hacmi V, kromatografik bandın merkezinden ölçüldüğü üzere çözünen maddenin ayrıştırılması için gereken çözücü hacmidir. V ve r, aşağıdaki denklemle ilişkilendirilebilir:
K = r, xf
f, akış oranını temsil eder.
Saklama hacmi doğrudan dağıtımla ilgilidir veya sabit ve hareketli fazlar arasında çözünen maddenin (K) bölme katsayısıdır. Burada V, mobil fazın hacmi ve V, sabit fazın hacmidir.
Bir kromatografik kolonun verimliliği, kolonun eşdeğer olduğu teorik plakaların (N) sayısı ile ölçülür.
Terim başlangıçta damıtma sürecini tanımlamak için kullanılmıştır ve ilgili fazlardaki çözünen konsantrasyonların dengede olduğu varsayıldığı bir dizi varsayımsal katman olarak görselleştirilebilir. Teorik plakaların sayısı aynı zamanda bir kolonun neden olduğu bant genişlemesi miktarının bir ölçüsüdür. Formülden hesaplanabilir.
Genel olarak, başlangıçta enjeksiyon hacimlerinin bir Poisson dağılımı verecek şekilde yayılacağı ve ardından bir Gauss dağılımına geçeceği varsayılır. Tipik bir Gauss zirvesi gösterilmektedir.
Levha numarasının belirlenmesi, bir detektör çizelgesi kaydından basittir, çünkü bükülme noktasında böyle bir eğriye teğetler, taban çizgisini 40 mesafeden keser.
Tepe şekillerinin Gauss olduğunu varsayarsak, tepe genişliği 40 ile verilir. Bu, kromatogramdan ölçülen parametre olabilir ve bu nedenle yukarıdaki formül şu şekilde yazılabilir:
N = 16X (t, / 4) 2
Bununla birlikte, en az hataya neden olan yöntem, tepe genişliğini yarı yükseklikte ölçmektir. Bir Gauss eğrisinin matematiksel özelliklerini kullanarak bu, aşağıdaki formüle yol açar:
N = 5.54 X (t, / yarım yükseklikte genişlik)
N, genellikle sütun performansının bir ölçüsü olarak alıntılanır ve sayı ne kadar büyükse sütun o kadar iyi olur. Genel olarak, küçük partikül çapları, düşük akış hızları, daha yüksek sıcaklıklar, daha az viskoz çözücüler, küçük çözünen moleküller ve iyi kolonlar için N artar.
N’nin değeri, çözünen maddenin tutma süresinden bağımsızdır ancak kolon uzunluğuyla orantılıdır. Farklı kolonlar arasında doğrudan bir karşılaştırma yapılmasını sağlamak için teorik bir plakaya eşdeğer yüksekliğin, H (plaka yüksekliği olarak da adlandırılır) kullanılması daha kullanışlıdır. Aşağıdaki formülle verilir:
H = L / N
burada L, sütunun uzunluğudur. H, bir çözünen maddenin yaydığı miktarı, sahip olduğu mesafeyle karşılaştırır.
ve bunu verimli sütunların H için küçük değerlere sahip olduğu izler. Bir kolonun sonunda bir çözünen maddenin dağıldığı mesafenin ile verildiği gösterilebilir.