Histokimyasal Teknikler – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Fiksatif seçimi, araştırılan belirli enzime bağlıdır ve enzim aktivitesi ile morfolojik görünüm arasında bir uzlaşmadır. Kısa fiksasyon sürelerinden sonra bile, oksidatif enzimlerin çoğu inaktif hale getirilir, ancak daha önce belirtildiği gibi, hücresel morfolojiyi ve son reaksiyon ürününün lokalizasyonunu korumaya yardımcı olmak için bu enzimler gösterildikten sonra fiksasyon kullanılabilir.
Doku Hazırlama
Enzimlerin incelenmesi için birkaç farklı yöntem mevcuttur, ancak bu bölümde sadece donmuş kesitler, yaymalar ve parafin bölümleri ele alınacaktır. Daha önce belirtildiği gibi, gösterilmesi gereken enzimler esas olarak kullanılan preparat tipine karar verecektir.
Dondurulmuş bölümler
Enzim histokimyasında en yaygın örnek hazırlama, genellikle bir kriyostat ile kesilmiş donmuş kesitlerin kullanılmasıdır. Yavaş dondurma buz kristali eserlerine neden olacağından doku hızlı bir şekilde hızlı dondurulmalıdır: daha hızlı dondurma daha küçük buz kristalleri üretir. Kas biyopsileri, tanısal enzim histokimya örneklerinin çoğunu açıklar, ancak buz kristali artefaktına çok eğilimlidir.
Kası dondurmak için en uygun yöntem, sıvı nitrojen ile dondurulmuş ve kısmen çözülmesine izin verilen izopentan kullanmaktır. Katı fraksiyon, dokunun donması sırasında sıvı fraksiyonun sıcaklığını sabit (150 ° C) tutarak termal bir tampon görevi görür. Doku (sabitlenmiş veya sabitlenmemiş) OCT jeli içinde bir mantar disk üzerinde yönlendirilir ve jel ve numune donana kadar eritme izopentanına daldırılır.
Mantar, OCT bileşiği kullanılarak blok tutucuya benzer şekilde tutturulur ve daha sonra 23 ° C’de bölümlemeye hazır şekilde kriyostat içine yerleştirilir. Tek başına sıvı nitrojen kullanılmamalıdır, çünkü düşük bir termal iletkenlik oranına sahiptir ve doku çevresinde gazlı bir termal bariyer oluşturur ve bu da büyük buz kristallerinin oluşmasına izin vererek hücresel hasara neden olur.
Lekeler
Yaymalar, kan, kemik iliği ve doku hücresi süspansiyonlarından çeşitli yöntemlerle hazırlanabilir. Doku lekeleri, örn. lenf düğümleri, taze dokunun kesildiği ve yeni yüzeyin temiz bir cam slayta nazikçe dokunduğu durumlarda da yararlıdır. Çoğu yayma havayla kurutulur ve hücrelerin sitokimyasal boyanmasından önce genellikle soğuk asetonla birkaç saniye süreyle (gerekli enzimlere bağlı olarak) hafifçe sabitlenir.
Parafin mumu bölümleri
Çoğu enzim, standart parafin mumu işlemenin etkilerine dayanmayacaktır ve bu nedenle bu hazırlama modu çoğu zaman yararlı değildir. Bununla birlikte, peroksidaz ve kloro-asetat esteraz, rutin parafin balmumu gömülmesine dayanmak için yeterince dayanıklıdır ve kolayca gösterilebilir. Diğer bazı enzimler, düşük erime noktalı mumlarla özel bir program kullanılarak kısmen öngörülebilir, ancak bu nadiren kullanılır.
Histokimyasal teknikler
Histokimyasal yöntemler
İmmünohistokimya işlem Basamakları
Histokimyasal Nedir
İmmünohistokimyasal
Histokimyasal ve immunohistokimyasal boyalar
İmmünohistokimyasal yöntemler nelerdir
Histokimyasal boyalar hangi amaçla kullanılır
Histokimyasal Teknikler
Bu histolojik yöntemler, enzimlerin asla boyanmaması bakımından benzersizdir; sadece reaksiyon ürünleri gösterilmiştir. Anlamlı sonuçlar için, enzim reaksiyonunun dikkatli bir şekilde optimize edilmesi ve reaksiyon ürününün renklendirilmesi önemlidir.
Proses, bir birincil reaksiyon ürünü (PRP) oluşturmak için bir substratın dokuya bağlı enzim tarafından bölünmesini içerir. Bu PRP, daha sonra, çözünmez ve enzim bölgesinde olması gereken bir nihai reaksiyon ürünü (FRP) oluşturmak için bir tutma ajanı olarak bilinen bir kimyasal ile reaksiyona girebilir. Çok sayıda faktör reaksiyonları etkiler ve hepsi dikkatlice kontrol edilmelidir.
İnkübasyon solüsyonlarının pH’ı çoğu enzim reaksiyonu için kritiktir ve uygun tamponlar kullanılarak muhafaza edilir. Sıcaklığın değiştirilmesi enzim reaksiyon hızını değiştirebilir, bazı yöntemler 37 ° C’de inkübasyon gerektirirken diğerleri oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
Optimal altı oda sıcaklığı, PRP ve yakalama ajanı ile FRP oluşumunun tamamlanması için daha fazla zaman sağlar, böylece enzim reaksiyon hızını düşürerek FRP’nin enzim bölgesine lokalizasyonunu geliştirir.
Substratlar ve tutucu ajanlar, etkileşimleri önlemek için seçilmeli ve her ikisi de hücre zarları boyunca kolayca yayılabilmelidir. Hem substrat hem de yakalama ajanı, hızlı enzim aktivitesi sırasında lokal tükenmeyi önleyecek bir konsantrasyonda kullanılmalıdır, ancak enzim reaksiyonunu inhibe edecek bir konsantrasyonda kullanılmamalıdır.
Bir yakalama ajanının seçimi, kullanılan enzim yöntemine ve enzimin içinde bulunduğu doku tipine bağlıdır. Örneğin, kas üzerinde metal çökeltme yöntemi kullanılırken, kurşun tuzuna kalsiyum tuzu tercih edilir, çünkü ikincisi kas ile spesifik olmayan bir şekilde bağlanabilir.
Çoğunlukla alt tabaka seçimi de vardır, ancak doğal olarak oluşan pek çok alt tabaka ucuz olsa da spesifik olmayabilir veya tamamen uygunsuz olmayan PRP’ler üretebilir. Özel olarak sentezlenen substratlar genellikle üstün sonuçlar verir.
Reaktiflerin kalitesinin ve kullanılan protokolün doğruluğunun değerlendirilebilmesi için histokimyasal boyama sırasında pozitif kontrol dokusunun dahil edilmesi önemlidir. Sübstratın inkübasyon ortamından çıkarılması veya spesifik inhibitörlerin dahil edilmesi, bir negatif kontrol görevi görecektir.
Enzim Reaksiyon Yöntemleri
Histopatolojide, çoğu enzim, (a) eşzamanlı bağlama veya (b) inkübasyon sonrası bağlama kullanılarak gösterilir.
Eşzamanlı bağlantı
Eşzamanlı bağlama, gerekli ko-faktörlerle hem substratı hem de bir yakalama ajanını içeren yalnızca bir çözüm gerektirir. Dokuya bağlı enzim, bir PRP üretmek için solüsyondaki substratla reaksiyona girer. Tutma ajanı (ayrıca çözelti halinde) bir FRP oluşturmak için anında PRP’ye bağlandığından, PRP çözünmez veya çözünür olabilir. Bu çözünmeyen FRP, enzim bölgesine bağlıdır ve renkli veya renksiz olabilir, ancak ikincisi görselleştirme için ek bir renklendirme adımı gerektirecektir.
İnkübasyon sonrası bağlantı
PRP üretimi için gerekli koşullar FRP üretimi için gerekli olandan farklı olabileceğinden, ara sıra substrat ve yakalama ajanının tek bir çözümde olması mümkün değildir. Bazen yakalayıcı ajan da enzim fonksiyonuna müdahale edebilir veya bunu inhibe edebilir. İnkübasyon sonrası birleştirme yöntemlerinde, ilk çözelti yalnızca substratı ve gerekli tüm yardımcı faktörleri içerir.
Üretilen PRP, yanlış negatifler veya FRP’nin brüt difüzyonu meydana geleceği için çözünmez olmalıdır. Yakalama ajanını içeren ikincil bir çözüm daha sonra yukarıdaki gibi FRP’yi üretmek için uygulanır. Pratikte inkübasyon sonrası birleştirme yöntemleri için uygun substratlar bulmak zordur ve bunun sonucunda nadiren kullanılır.
Histokimyasal boyalar hangi amaçla kullanılır Histokimyasal Nedir Histokimyasal teknikler Histokimyasal ve immunohistokimyasal boyalar Histokimyasal yöntemler İmmünohistokimya işlem Basamakları İmmünohistokimyasal İmmünohistokimyasal yöntemler nelerdir