Bir CGH mikrodizi deneyi için 0,1-0,5 mg DNA gereklidir. Bunu, özellikle formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokuların küçük örneklerinden elde etmek zor olabilir. Verimi arttırmak için, DNA'nın spesifik olmayan bütün genom amplifikasyonu gerçekleştirilebilir. Dejenere oligonükleotid ile hazırlanmış polimeraz zincir reaksiyonu, verimli ve güvenilir bir tam genom amplifikasyon tekniğidir.
Bu tip PCR, dejenere oligonükleotitleri içeren bir primer kullanır. Amplifikasyon prosedürü iki adıma ayrılmıştır. İlk kısım, düşük tavlama sıcaklıklarında (32 C) gerçekleştirilen ve DOP primerinin sık bağlanmasına izin veren beş PCR döngüsünü içerir.
Bu, belirli bir genom içinde eşit olarak dağılmış bölgelerden bir DNA dizileri havuzu oluşturur. İkinci adım, 35 döngü için 62 C'lik daha katı bir tavlama sıcaklığına sahiptir, bu da daha spesifik astarlama ile sonuçlanır.
Bu iki aşamalı prosedürün sonucu, ilk aşamada sentezlenen tüm dizilerin üstel amplifikasyonudur ve büyük miktarda DNA ile sonuçlanır. Yayınlanmış birkaç grup, hem DNA verimini hem de yöntemin güvenilirliğini geliştirmek amacıyla orijinal DOP-PCR protokolünü bir şekilde değiştirmiştir.
Yöntemin performansını test etmek için, pozitif kontrol olarak tümör hücre hatlarından ekstrakte edilen DNA'ların bir karışımı kullanılabilir. Vysis, aşağıdaki hücre dizilerinin bir karışımı olan CoSH'yi kullanır: COLO 320 HSR (kolonik adenokarsinom), %35; SJSA-1 (osteosarkom), %40; ve BT-474 (meme karsinomu), %25, belirli lokuslarda bilinen kopya sayısı kazanımları ve kayıpları ile yapılır.
DNA Etiketleme ve Hibridizasyon
Mikrodizilere tek tip, yoğun hibridizasyon elde etmek için, DNA prob fragman boyutu 200-400 baz çifti olmalıdır ve bu, DNA'nın rastgele etiketlenmesi ve bu optimum fragman uzunluğuna sindirilmesiyle sağlanır. Vysis ve Spectral Genomics tarafından önerilen doğrudan etiketleme yönteminde, floroforlar Cy3 ve Cy5, sırasıyla örnek DNA'ya ve tüm genomik referans DNA'ya doğrudan bağlanır.
DNA'lar birlikte karıştırılır ve etiketlenmemiş insan Cot-1 DNA'sının varlığında bir mikrodiziye birlikte hibritlenir. Cot-1 DNA, tekrarlayan DNA dizileri için zenginleştirilmiş, 50-100 baz çifti uzunluğunda plasental DNA'dır ve işlevi, etiketli DNA'nın yüksek oranda polimorfik tekrar dizileri içeren sentromerik ve heterokromatik bölgelere bağlanmasını engellemektir. Bu bölgelerin bloke edilmesi, analize dahil edilmelerini engeller, böylece kırmızı:yeşil oranının optimal genliğine izin verir.
Nemli bir inkübatörde 37°C'de 2-4 gün hibridizasyondan sonra, hibritleşmemiş probları çıkarmak için talaşlar yıkanır. 4,6-diamidino-2-penylindol (dizi DAPI) karşıt olarak uygulanır.
Her slayt için görüntü yakalama ve saklama süresi yaklaşık 1 saattir. Bir floresan görüntüleme sistemi, hibritleştirilmiş çipin görüntüsünü üç renk düzleminde yakalar: Cy3, Cy5 ve DAPI mavisi. Vysis GenosensorTM Array 300, sırasıyla DAPI karşı boyamaya (mavi), test DNA'sına (yeşil) ve referans DNA'ya (kırmızı) özgü her bir mikrodizinin üç görüntüsünü yakalamak için bir CCD kamera ve 175 W xenon aydınlatma kaynağı kullanır.
DNA hibridizasyonu
Dna hibridizasyonu nedir
Nükleik asitlerin hibridizasyonu
Hibridizasyon Nedir
Nükleik asit hibridizasyonu
DNA hibridizasyon yöntemleri
Moleküler hibridizasyon
Floresan in situ hibridizasyon Nedir
Mavi görüntü, ızgaradaki hedef noktaları belirlemek ve lokalize etmek için kullanılır. Noktalar belirlendikten sonra, yeşil ve kırmızı floresan yoğunluklarını birleştiren, yerel arka planı çıkaran ve her nokta için test yoğunluğunun referans yoğunluğuna (T:R) oranını hesaplayan özel yazılım kullanılarak nicel olarak analiz edilebilir (üç her hedef gen için noktaları çoğaltın).
Şekil 54.2, elbette, ortalama T:R oranları, bir kontrol noktası veya nokta grubuna göre normalleştirilmelidir. Vysis sistemi bunu, normal görünen noktaları tespit ederek ve tüm T:R oranlarını "normal" hedeflerin T:R oranına bölerek yapar.
Mikrodiziler, özellikle ifade dizileri üzerinde temsil, yoğunluktaki artışlar, veri depolama ve biyoinformatik daha zor hale geleceğinden ve hatalı sonuçlara yol açabilecek kusurlu verileri önlemek istiyorsak, kusursuz toplama, analiz ve yorumlama yöntemleri büyük önem taşımaktadır. sonuçlar.
Bunu önlemek için, istatistik ve biyoinformatik, moleküler biyologların eğitiminde hızla öne çıkan bileşenler haline geliyor.
Sonuç
Mikroarray teknolojisinin gelişmesinden bu yana moleküler biyolojinin yeniden şekillendiğini gördük ve bu teknolojinin karşılaştırmalı genomik hibridizasyon ile birleştirilmesi, tek bir testte çoklu hedef değerlendirmesine olanak tanıyan güçlü bir araç olarak ortaya çıktı.
Bu paha biçilmez teknik, hem tümörlerin patogenezinde hem de genomik profil hastalık yönetiminin geliştirilmesinde rol oynayabilecek yeni genlerin saptanmasını hızlandırdı.
DNA Dizilimi
1940'ların ortalarında Avery, MacLeod ve McCarty tarafından kimyasal deoksiribonükleik asit DNA'nın tanımlanması, DNA'nın kalıtımın malzemesi, sözde yaşamın maddesi olduğunu ilk kez gösterdi.
Bu tek keşif, moleküler genetiğin, gen terapisinin, genetik danışmanlığın ve gen ekspresyonunun in vitro olarak manipüle edilmesini sağlayan bilimin temellerini attı.
İskoçya'da Edinburgh'daki Roslin Enstitüsü'nde koyun 'Dolly'nin klonlanması gibi rekombinant DNA tekniklerinin en son uygulamalarının yayınlanmasından ilham alan tabloid öfkelerine yol açan tekniklerin temelini sağladı ve bu on yılın başlarında insan genomundaki 3 milyar DNA harfini sıralamak için uluslararası çaba gösterildi.
1953 yılında bu çift sarmallı DNA molekülünün üç boyutlu yapısı çözülmüş ve James Watson ve Francis Crick tarafından yayınlanmıştır.
Kalıtsal değişimden sorumlu molekülün kimliği ve yapısı keşfedildiği için, genetik kodun dili adenin (A), sitozin (C), guanin (G) ve timin (T) olmak üzere dört baza dayalıdır. kurulmuş. Bu bilginin DNA baz dizisinden proteinlere akışı artık bilimsel bir şüpheye yer bırakmayacak şekilde aydınlatılmış ve netleştirilmiştir.
Uygulamalı moleküler biyolojinin başarılı bir şekilde doğması ve olgunlaşması için kritik olan kilit olaylardan, nükleik asitlerin bireysel baz dizisini belirlemeye yönelik yöntemlerin keşfi en önemlileri arasında yer almalıdır.
Sıralama teknolojisi şu anda tıp bilimi ve adli tıptan popülasyon genetiği, filogenetik ve koruma genetiğine kadar çok çeşitli disiplinlerde kullanılmaktadır. Karşılaştırmalı genomik, ilaç keşfi ve genetik tarama çağına girerken, yüksek verimli dizileme teknolojilerine olan talep her zamankinden daha fazladır.
DNA dizilerini hızla belirleme yeteneği, moleküler genetik biliminde devrim yarattı. Çeşitli kaynaklardan DNA dizileri elde edilmiştir ve EMBL veri tabanı, DDBJ ve GenBank gibi geniş depolar, uluslararası nükleik asit dizileri stokları olarak mevcuttur.
Bu veri bankaları, bilim adamlarının evrimi, mutasyonları, filogeniyi incelemek ve nihayetinde dizi bilgisini eksiksiz biyolojik sistemlerin karakterizasyonuna uygulamak için elektronik erişime sahip oldukları bir nükleik asit kütüphanesi olarak hizmet eder. Bu bölümün amacı, bu dizileme teknolojisini ve özellikle İnsan Genom Projesi'ndeki uygulamalarını gözden geçirmektir.
Gösteri Yöntemleri
Renkli FRP’ler normalde aşağıdaki yöntemlerden biriyle üretilir:
1. Metal çökeltme.
2. Azo boya.
3. Tetrazolyum tuzu.
4. Indigogenic yöntem.
Diğer yöntemler şunları içerir:
5. Kahverengi bir pigment oluşturmak için 3,3-diaminobenzidinin (DAB) sitokrom oksidaz veya peroksidazlarla oksidasyonu.
6. İyotlu mavi / siyah renkli bir polisakkarit üretmek için glikojenin fosforilaz tarafından metabolizması.
Metal Çökeltme Yöntemleri
Fosfatazları tanımlamak için rutin olarak metal çökeltme yöntemleri kullanılır, örn. asit fosfataz, alkalin fosfataz ve adenozin trifosfataz.
Substrattan fosfat iyonlarının salınmasına dayanırlar ve daha sonra çözelti içindeki kurşun veya kalsiyum tuzları ile reaksiyona girerler (yakalama ajanı), kurşun veya kalsiyum fosfatın çözünmeyen FRP’sini oluşturmak içindir.
Kurşun fosfat renksizdir ancak kurşun sülfit oluşturmak için amonyum sülfit çözeltisi ile kararır. Kalsiyum fosfat, alkali pH’ta çözünmez ve siyah kobalt sülfit oluşturmak için amonyum sülfit ile işlemden geçirilmeden önce kobalt klorür çözeltisi ile kobalt fosfata dönüştürülmesi gerekir. Bu yöntemlerin her ikisi de zamanla solma eğilimindedir, ancak amonyum sülfür ile yeniden renklendirilebilir.
Substrat asetil tiyokolin kullanan asetil kolinesteraz yöntemi, kahverengi bakır ferrosiyanür oluşturmak için sırasıyla bakır sülfat ve potasyum ferrisiyanür ile reaksiyona giren bir tiyokolin PRP’si üreten bir metal çökeltme yöntemi olarak kabul edilebilir.
Hidrometalurjik yöntemler
Ağır metal tuzları ile çöktürme deneyi
Liç sonrası metal elde etme yöntemleri
Hidrometalurjik bakır üretimi
Hidrometalurjik prosesler
Bakır çöktürme
Hidrometalurjik proses üretim kademeleri
Liç Nedir
Azo Boya Yöntemleri
Azo boya yöntemleri, asit ve alkalin fosfatazları, spesifik olmayan esterazı ve kloroasetat esterazı tanımlamak için kullanılır. Farklı substratlar, yukarıdaki enzimlerden biri tarafından ayrılabilen bir naftol grubu içerir. Renkli bir çözünmez azo boyası oluşturmak için naftol grubu ile reaksiyona giren çeşitli diazonyum tuzları veya yeni heksazotize edilmiş pararosanilin kullanılır.
Tipik olarak, kullanılan diazonyum tuzları arasında hızlı bir şekilde monte edilmesi gereken Fast Red TR, Fast Blue RR, Fast Blue B ve Fast Garnet GBC bulunur. Heksazotize edilmiş pararosanilinden oluşturulan azo boya, ışık mikroskobunda optik lokalizasyonu geliştiren sentetik bir reçineye monte edilebildiği için tercih edilen yöntemdir. Diazonyum tuzları, eş zamanlı veya inkübasyon sonrası birleştirme yöntemleriyle kullanılabilir.
Tetrazolyum Tuzu Yöntemleri
Tetrazolyum tuzları, formazanlar olarak bilinen oldukça renkli suda çözünmeyen mikro kristal birikintiler oluşturmak için alt tabakadan enzimatik olarak salınan hidrojeni kabul eden renksiz, suda çözünür tuzlardır.
Süksinik dehidrojenaz gibi birçok oksidatif enzim, metiliyazolildifenil tetrazolyum ve nitro mavi tetrazolyum (NBT) gibi tetrazolyum tuzları kullanılarak gösterilmiştir. Diazonyum tuzlarında olduğu gibi, çeşitli faktörler seçimlerini etkiler, ancak sentetik bir reçineye monte edilebildiği için NBT genellikle MTT’ye tercih edilir.
Indigogenic Yöntem
Çeşitli substratlar, bir PRP olarak salınan ve daha sonra turkuaz bir FRP oluşturmak için yakalama ajanı potasyum ferrisiyanür tarafından oksitlenen bir indoksil grubu içerir (Şekil 3.3). İnkübasyon solüsyonu ayrıca FRP’nin aşırı oksidasyonunu önleyen potasyum ferrosiyanür içerir.
Enzim histokimyasının tanısal uygulamaları
Enzim histokimyası, aşağıdakiler gibi çeşitli teşhis uygulamaları için kullanılabilir:
1. İskelet kası lifi tiplemesi.
2. Hirschsprung hastalığından şüphelenilen sinirler ve gangliyonlar.
3. Malabsorpsiyonu değerlendirmek için gastrointestinal doku.
4. Lenfoid ve miyeloid hücrelerin gösterilmesi.
5. Erken karaciğer dejenerasyonunun belirlenmesi.
İlk iki uygulama en yaygın olanıdır, ancak alışılmadık şekilde özel teşhis merkezleriyle sınırlıdır.
İskelet Kası
Nöromüsküler hastalıkların ve konjenital miyopatilerin teşhisinde enzim histokimyasının kullanımı, pek çok histopatolojik görünümün ancak enzim histokimyasının ortaya çıkmasından sonra tanınması ve tarif edilmesiyle sağlam bir şekilde yerleşmiştir.
Çizgili kasın geleneksel renklendirmeli boyaması, iltihaplı tepkileri ve lif boyutundaki değişiklikleri göstermek için yeterlidir, ancak çeşitli kas lifi türleri arasında ayrım yapamaz. Bu, birçok hastalık süreci belirli kas lifi türleriyle sınırlı olduğu veya bu türlerde değişiklik gösterdiği için önemlidir.
Bu, atrofi veya hipertrofi şeklinde ve bazı hastalıklarda iç hücresel yapının değişmesi şeklinde olabilir. Enine kesilmiş iskelet kasına enzim histokimyasal yöntemlerinin uygulanması, birkaç farklı lif tipinin ayırt edilmesini sağlar ve bu liflerin dağılımlarının ve boyutlarının incelenmesi tanıya yardımcı olabilir.
Çizgili kas lifleri, pH 9.4’te gösterilen ATPase aktivitesi düzeyine bağlı olarak, genel olarak Tip 1 ve Tip 2’ye bölünebilir. ATPase boyama, pH 4,2 veya 4,6’da bir tamponda ön inkübasyondan sonra uygulanırsa, Tip 2 fiberlerin 2A, 2B ve 2C alt tiplerine daha fazla farklılaşması sağlanabilir.
Gösterilmesi gereken bir diğer önemli enzim, McArdle hastalığında çizgili kas hücrelerinde eksik olan, ancak kan damarlarının düz kas hücrelerinde hala mevcut olan ve bu nedenle yararlı bir doğal kontrol görevi gören fosforilazdır.
NADH diyaforaz (indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotid) mitokondri ve sarkoplazmik retikulum ağını gösterdiği için kas hücrelerinin iç yapısını incelemek için kullanılır. Bu, ATPase tarafından gösterilen miyofibriler dağılımla karşılaştırıldığında, çeşitli patolojik durumlar ortaya çıkabilir.
Anormal enzim dağılım modelleri, genellikle, “hedef lifler”, “halka lifler” ve “merkezi çekirdekler” gibi belirli bir hastalık varlığına özgü görünümleri açısından tanımlanır.
Sitokrom oksidaz, süksinik dehidrojenaz ve laktat dehidrojenaz, mitokondri için daha spesifiktir ve mitokondriyal miyopatilerin belirlenmesinde yardımcı olabilir. İskelet kasının diferansiyel enzim boyamasının bir özeti gösterilmektedir.
Son zamanlarda, parafinle işlenmiş doku üzerinde güvenilir kas lifi tiplemesi için immünohistokimyasal yöntemler geliştirilmiştir. Bu, bu tür işlenmiş dokular için önemli tanısal potansiyele sahip olsa da, teşhis açısından önemli olan diğer enzimlerin veya bunların metabolik aktivitesini gösterme yeteneklerinin tanımlanmasına izin vermez.
Sinirler ve Gangliyonlar
Normal kolon ve rektumda, kolon hareketliliğinden sorumlu ganglion hücreleri ve ilişkili sinirler bulunur. Hirschsprung hastalığında çocuklarda, dairesel ve uzunlamasına düz kas bileşkesi (miyenterik pleksus) arasında ve submukozada gangliyon yokluğu vardır.
Ayrıca submukozada ve lamina propriada non-argyrofilik sinir liflerinin sayısında ve kalınlaşmasında belirgin bir artış vardır. Ganglion hücreleri bir H&E bölümünde kolaylıkla tanımlanabilir ancak sinir lifleri çok daha zordur.