Benzil, nitrobenzil, fenasil, p-bromofenasil, metoksifenasil, I-naftilamid ve 2-naftalasil türevleri, 254 nm dalga boyunda UV detektörleri ile izlenebilir ve yaklaşık 4 ng’lik bir alt tespit limiti öneren hassasiyetler rapor edilir.
Yağ asitlerinin 2-naftasil türevlerinin flüoresan tespiti ayrıca sırasıyla 290 nm ve 450 nm’lik eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile de kullanılabilir ve bu, gelişmiş tespit hassasiyeti sağlar.
Türetilmiş yağ asitlerinin kromatografisi genellikle metanol-su veya asetonitril-suyun hareketli fazları ile ODS durağan fazlarında gerçekleştirilir, ancak organik modifiye edicinin konsantrasyonu genellikle az iyonlaştırılmış yağ asitlerinin kromatografisinde kullanılandan daha yüksektir.
Yağ asidi türevlerinin elüsyon sırası, türetilmemiş türlerde gözlemlenen ile aynıdır, yani, yağ asidinin zincir uzunluğu arttıkça tutma süresi artar ve doymamışlık derecesi arttıkça azalır. Ters fazlı kromatografi, yağ asitlerinin ve bunların türevlerinin ayrılması için ezici bir çoğunlukla en popüler teknik iken, diğer kromatografik modlar kullanılmaktadır.
Fosfolipitlerin görevleri
Fosfolipit ne ise yarar
Fosfolipit nerede bulunur
Sfingomiyelin
Fosfolipit zar
Fosfolipit görevi
Gliserofosfolipidler
Lipidler Biyokimya
Örneğin, kısa zincirli karboksilik asitlerin p-bromofenasil esterlerinin eklem bacaklılardan ayrılması için, kloroform-heksan karışımlarının hareketli faz gradyan sistemleri ile bir silika sabit faz kullanan normal faz kromatografisi kullanılmıştır.
Tartışma kromatografisi daha sonraki bir bölümde ayrıntılı olarak tartışılacaktır ve ayrıca yağ asitlerinin kromatografisinde de kullanılmıştır. Genel olarak, yağ asitlerinin argentasyon kromatografisi için en yaygın olarak kullanılan sabit faz, seyreltik gümüş nitrat çözeltileri ile yüklü bir silika kolonudur.
Kullanılan mobil faz genellikle, asetonitril gibi daha polar bir organik modifiye edicinin küçük bir yüzdesinin eklendiği heksandır. Argentasyon kromatografisi, yağ asidi metil esterlerinin geometrik izomerlerinin ayrıştırılması ve ayrıca linoleik metil esterlerinin konumsal izomerlerinin ayrıştırılması için kullanılmıştır.
Bununla birlikte, genel olarak, GLC analizinden önce bir ön fraksiyonasyon yöntemi veya genel bir çözümleme yöntemi olarak, argentasyon HPLC’nin, temelde ayırmak için kullanıldığı durumlar haricinde, ters fazlı HPLC’den daha az yararlı olduğu kabul edilmektedir.
Fosfolipidler
Fosfolipidlerin izolasyonu ve miktar tayini için HPLC’nin piyasaya sürülmesinden bu yana, ayırmaların büyük çoğunluğu, çok çeşitli mobil fazlara sahip silika kolonları üzerinde normal faz kromatografik teknikleri kullanmıştır.
1975 yılında, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, lizofosfatidiletanolamin ve etanolamin plazmalojenlerinin bifenil-karbonil türevlerinin ayrılması, hareketli bir diklorometan-metanol-15 M sulu amonyak fazı ile bir silika sabit faz kullanılarak gösterilmiştir.
Bu raporu, aynı gruptan, türetilmemiş sfingomiyelin ve fosfatidilkolinin, asetonitril-metanol-su mobil fazı ile kombinasyon halinde bir silika sabit faz üzerinde çözünürlüğünü gösteren başka bir rapor izledi.
Mobil faza bir asit veya bir bazın dahil edilmesinin, silika ince tabakalı kromatografi plakaları üzerinde fosfolipitlerin gelişmiş bir ayrılmasını sağladığı gözlemi, bazı grupların HPLC mobil fazına fosforik asit veya sülfürik asit dahil etmesini sağlamıştır.
Şekil 11.3.2’de, doku lipit özlerinden tüm ana fosfolipid bileşenlerinin çözünürlüğü, asetonitril-metano 1-85% fosforik asitin hareketli bir fazı ile bir silika sabit faz kullanan tek bir kromatografik çalışmada gösterilmektedir.
Bu kromatogramda, birlikte yıkanan fosforik asit ve fosfatidilgliserolün karakteristik çukur ve zirvesi gösterilir. Bu koşullar altında, çözücü cephesindeki kardiyolipin ve nötr lipidlerin elüsyonu, kolon performansının kötüleşmesi durumunda fosfatidilinositolün saptanmasını engelleyebilir ve yazarlar, silika kolonunun her gün 30 ml metanol-su, metanol ve diklorometan ile yıkanmasını önermektedir.
Mobil faza fosforik asidin dahil edilmesi, lipid fosfor tayinleri ile sonraki miktar tayininde hata potansiyelini arttırır ve fosfatidilinositol, fosfatidilserin, fosfatidilserin, fosfatidil-etanolamin, fosfatidilkolin, lisofosfatidilkolin ve sfingomiyeline dönüşür.
Yazarlar, mobil fazın sülfürik asit içeriğindeki bir azalmanın, ayrıştırılan piklerin genişlemesine ve fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin ve fosfatidilkolin retansiyonunda bir artışa neden olduğunu, ancak ihmal edilirse bu bileşenlerin ayrışmadığını da bildirdi.
Ayrıca, mobil fazın metanol içeriği arttırılırsa, tüm fosfolipidlerin alıkonma sürelerinin azaldığı da not edildi. Bu nedenle numuneler, mobil fazdaki metanol konsantrasyonunun değiştirilmesini önlemek için kloroform-dietil eter içinde de enjekte edildi.
Heksan-propanol-su, kloroform-propanol-asetik asit-su ve kloroform-metanol karışımlarını içeren mobil fazlar kullanılarak silis üzerinde fosfolipitlerin birkaç başka izokratik ayrımı da bildirilmiştir.
Yaygın olarak oluşan fosfolipidlerin gelişmiş bir çözünürlüğü için potansiyel sunan bir dizi gradyan sistemi açıklanmıştır. Bu gradyan sistemlerinden biri, yakın zamanda keşfedilen biyolojik olarak aktif l-alkil-2-asetil-m-gliserol-3-fosforilkolinin (alkilasetil-GPC; trombosit aktive edici faktör; PAF) çözünürlüğünü de göstermektedir.
Sabit faz,% 96 2-propanol-hekzan (1: 1) -% 4 sudan başlayan, doğrusal gradyan ile% 8 suya 15 dakikalık bir süre zarfında mobil faz ile silikadır. Bu kromatografik koşullar altında, elüsyon sırası şöyleydi:
fosfatidilgliserol, fosfatidiletanolamin / fosfatidil-inositol, fosfatidik asit, fosfatidilserin, heksadesil-asetil-GPC, asilasetil-GPC, lizofosfatidilkolin.
Silika sabit fazlarla kullanılan diğer gradyan sistemleri,% 100 pro-panol-etil asetat-benzen-su ila% 100 propanol-toluen-asetik asit-su mobil fazlarını kullanmıştır, ancak benzen ve toluen varlığına bağlı olarak bu hareketli faz sistemi, UV tespiti ile birlikte de kullanılamaz.
Alternatif bir sistem, bir sayının çözünürlüğü için% 70 heksan-2-propanol (50:50) ila% 100 heksan-2-propanol-tetrahidrofuran-0.1 M NH, C1 (40: 45: 5: 10) mobil fazlarını da kullandı.
Bu yazarlar, NH, Cl’nin mobil fazlarda bulunmasının, özellikle de fosfatidilserin ve fosfatidilinositolün hissedilen tepe noktalarını keskinleştirdiğini de öne sürdüler.
Ayrıca, 2-propanol içeriğindeki bir azalmanın fosfolipidlerin daha erken ayrılmasına neden olduğu gözlenmiş ve 2-propanolün, iyonize grupların sabit fazın silika yüzeyi ile etkileşimini artırarak etki gösterebileceği de öne sürülmüştür.
Uzun süreler boyunca büyük miktarlarda su veya metanol içeren mobil fazların kullanılması, silika sabit fazın kararsızlığı nedeniyle sorunlara neden olabilir.
Bu zorlukların üstesinden, kloroform ve metanol-su içeren bir mobil faz gradyanı ile normal bir faz dolgusu olarak pBondapak-NH gibi bir anyon değişim sabit fazı kullanılarak aşılmıştır.
Kolondaki lipidlerin listesi şöyleydi: fosfatidik asit, fosfatidilgliserol, fosfatidilserin / tristearin, fosfatidilkolin.
Daha yeni bir rapora göre ise; kolesterol, serebrosid, fosfatidilkolin, sfingomiyelin, kolesterol, serebrosit, fosfatidilkolin, sfingomiyelin, lizofosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, lizofosfatidiletanolamin şeklindedir.