4. Aşılama halkanızla, slaydın halkalı alanına bir öze dolusu su koyun. Uygun aseptik transfer tekniklerini kullanarak, suda az miktarda bakteri karıştırın ve dağıtın. Üç organizmanın da bulaşması olana kadar bu adımı tekrarlayın.
5. Smearlerin kurumasını bekleyin. Her slaytta ince beyaz bir film görebilmelisiniz. Değilse, 4. adımda olduğu gibi bir öze dolusu su ve daha fazla bakteri ekleyin.
6. Smearların yıkanmaması için slaytları Bunsen alevinden üç kez hızla geçirerek lekeleri ısıyla sabitleyin. Bir Bunsen brülörü yoksa, slaytları bir boyama askısına yerleştirip onları mutlak metanol ile doldurarak lekeleri düzeltin. Slaytların bir dakika oturmasına izin verin, ardından alkolü boşaltın ve tamamen açık havada kurutun.
7. Slaytları bir boyama rafına yerleştirin ve metilen mavisi ile doldurun. Lekeyi üç dakika açık bırakın.
8. Her slaytı damıtılmış suyla nazikçe yıkayın, fazla suyu boşaltın, emzikli kağıtla kurulayın (ovalamayın) ve slaytları bırakın.
havada tamamen kurutun.
9. Slaytlar kururken, iki temiz slayt daha alın ve balmumu kaleminizle alt tarafa bir daire çizin veya
işaretleme kalemi.
10. Her slayttaki dairenin üzerine bir öze dolusu distile su (veya steril salin) koyun.
11. Bir kürdanın düz ucuyla, dişlerinizin yüzeyinden ve diş etlerinin etrafından bir miktar malzeme kazıyın. Emülsifiye
bir slaytta su damlası içindeki malzeme. Bu prosedürü diğer slaytta tekrarlayın.
12. Her iki slaydın da havada kurumasına izin verin; daha sonra bunları ısı veya metanol ile sabitleyin. Üç slayt için metilen mavisi ile bir slayt boyayın
dakika ve diğeri üç dakika safranin ile.
13. Slaytları 8. adımdaki gibi yıkayın, boşaltın ve kurutun.
14. Size atanan hazırlanmış lekeli smear dahil olmak üzere tüm slaytları üç mikroskop hedefiyle birlikte inceleyin.
Güneşteki iki leke
Güneş’te güneş lekesi
Güneş üzerindeki lekeler Nedir
Güneş’teki lekeler
Güneşteki lekeler azalırsa ne olur
Güneş lekesi Nedir kısaca
NASA güneş lekesi
Güneş lekelerinin sebebi nedir
Sorular
1. Asidik ve temel boyaları tanımlayın.Herbirinin amacı nedir?
2. Boyanacak bir slaytı sabitlemenin amacı nedir?
3. Örnekler neden steril tuzlu su veya damıtılmış suda süspanse edilmelidir?
Bakteri incelemek içinemikroskop hedeflerinden hangisi yetersizdir?
5. Bakterilerin morfolojisini ve hareketliliğini incelemek için lekeli bir preparat asılı bir damla ile karşılaştırıldığında nasıldır?
6. Bakterilerin temel şekillerini listeleyin ve tanımlayın. Mikrometrelerde, bir bazilusun mikrometrelerinde ne gibi detaylar var? İnsantimetreler?
7. İsimleri şekillerini ve düzenlemelerini yansıtan en az üç bakteri türünü listeleyin ve her ismin anlamını belirtin.
8. Bakterileri hangi nedenle lekelemeliyiz?
9. Renk plakaları 1–8’i inceleyin ve her birindeki bakterilerin morfolojisini tanımlayın.
Diferansiyel Lekeler
Gram Boyama
Egzersiz 4’te gerçekleştirilen basit boyama prosedürü, bakterileri net bir şekilde görmeyi mümkün kılar, ancak benzer morfolojiye sahip organizmalar arasında ayrım yapmaz.
1884’te Danimarkalı bir patolog olan Christian Gram, bakterileri pararosanilin boyalarla boyamak için bir yöntem keşfetti. Her biri farklı renkte olan iki boyayı sırayla kullanarak bakteri iki gruba ayrıldı. İlk grup, birincil boyanın rengini korur: kristal menekşe (bunlara gram pozitif denir).
İkinci grup renk giderici bir çözelti içinde yıkandığında ilk boyayı kaybeder, ancak daha sonra ikinci boyanın rengini, safranin veya karbol fuksin gibi bir zıt boyayı alır (bunlara gram negatif denir). Bir iyot çözeltisi, ilk leke için bir mordan olarak kullanılır (bir boyayı çözülmez bir bileşik oluşturmak için boyayla birleştirerek bir maddenin içine veya üzerine sabitleyen bir kimyasal) ilk leke için kullanılır.
Bu boyama tekniğinin tam etki mekanizması tam olarak anlaşılmamıştır. Bununla birlikte, bakteri hücre duvarlarının biyokimyasal bileşimindeki farklılıkların Gram boyama reaksiyonlarında paralel farklılıklar olduğu bilinmektedir. Gram pozitif bakteri duvarları, hücrelerin renksizleşmeye direnmesini sağlayan sıkı bir şekilde bağlanmış peptidoglikanlar (protein-şeker kompleksleri) bakımından zengindir. Gram negatif bakteri duvarları, renk gidericide (alkol, aseton veya bunların bir karışımı) çözünen ve kristal menekşe ile yıkanan yüksek konsantrasyonda lipidlere (yağlar) sahiptir. Renk giderici böylece karşıt boyama için gram negatif organizmaları hazırlar.
Gram boyama, mikrobiyoloji laboratuvarındaki en kullanışlı araçlardan biridir ve evrensel olarak kullanılmaktadır. Teşhis laboratuvarında, sadece kültürlerdeki mikroorganizmaları incelemek için kullanılmaz, aynı zamanda doğrudan klinik örneklerden yapılan yaymalara da uygulanır. Doğrudan, Gram boyanmış smearlar, örnekteki bakterilerin göreli sayılarını ve morfolojisini belirlemek için hemen okunur.
Bu bilgiler, kültür sonuçları alınmadan önce hastanın tedavisinin planlanmasında hekim için değerlidir. Kültür işlemlerini örnekte gördükleri bakteri formları hakkındaki bilgilerine dayanarak planlayabilen mikrobiyologlar için de değerlidir.
Gram’ın orijinal yönteminin çeşitli modifikasyonları, boyaların konsantrasyonuna, her bir boya için boyama süresinin uzunluğuna ve renk gidericinin bileşimine dayanmaktadır. Bu alıştırmada izlenecek olan Hucker’ın modifikasyonu günümüzde yaygın olarak kullanılmaktadır. Renk giderici ajan seçimi, bu adımı gerçekleştirmek için istenen hıza bağlıdır.
Bu alıştırmada öğrencinin renk giderimi konusunda deneyim kazanması için en yavaş ajan olan% 95 etil alkol kullanılır. Aseton en hızlı renk gidericidir,% 95 etil alkol ve asetonun eşit bir karışımı orta hızda etki eder. Aseton-alkol kombinasyonu muhtemelen teşhis laboratuvarlarında en popüler olanıdır.
Gram boyama tekniğini öğrenmek ve bakteriyel morfoloji çalışmasındaki değerini anlamak;
24 saatlik agar kültürü:
Staphylococcus epidermidis Enterococcus faecalis
Neisseria sicca
Saccharomyces cerevisiae (maya) Bacillus subtilis
Escherichia coli
Proteus vulgaris
Postoperatif yara enfeksiyonundan simüle edilmiş irin örneği Hucker’ın kristal moru
Gram iyot
Etil alkol,% 95
Safranin
Slaytlar
Kalem veya kurşun kalem ve slayt etiketlerinin işaretlenmesi
Prosedürler
1. Egzersiz 4’te ana hatlarıyla belirtilen prosedürleri takip ederek, 1-6. Adımlar (sayfa 34-35), her kültürden ve simüle edilmiş klinik numuneden sabit bir smear hazırlayın. Se, Ef, Ns, Sc, Bs olarak etiketlenmiş 7 smearınız olacak , Ec, Pv ve pus. Her slaydın alt tarafına, boyamadan sonra slaytları tanımlayabilmek için bir kod işareti yapın.
2. Her smearı aşağıdaki prosedürlerle boyayın (bu, Hucker’ın Gram boyası üzerinde yaptığı modifikasyondur):
a. Kristal mor ile taşkın slayt. Bir dakika beklemeye bırakın (eğitmenle kontrol edin; zaman farklı gruplara göre değişir
leke).
b. Musluk suyuyla yıkayın.
c. Gram iyotu (bir mordan) ile doldurun. Bir dakika bekletin.
d. Musluk suyuyla yıkayın.
e. Renk yıkama kalmayana kadar (genellikle 10-20 saniye) alkolle (% 95) rengini giderin. Bu çok kritik bir adımdır. Ol
Fazla renk atmamaya dikkat edin, çünkü birçok gram pozitif organizma mor lekeyi kolayca kaybedebilir ve bu nedenle
zıt boyandıktan sonra gram negatif.
f. Musluk suyuyla yıkayın.
g. Bir dakika boyunca safranin (karşıt boya) uygulayın.
h. Musluk suyuyla yıkayın.
ben. Emici kağıtla yavaşça boşaltın ve kurulayın. Hazırlığı mikroskop altında incelemeden önce slaytı havayla kurutun.
3. Slaytlar kuruduğunda onları gösterildiği gibi etiketleyin.
4. Yağa daldırma hedefi ile yağ altındaki tüm slaytları inceleyin.
5. Gözlemleri Sonuçlar altındaki tabloya kaydedin.
6. Hangi bakterilerin gram pozitif veya gram negatif olduğuna dikkat ederek renk plakaları 1-6 ve 8’i inceleyin.