Dallanmış Zincirli DNA – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Nükleik Asit Dizisine Dayalı Amplifikasyon
Nükleik asit dizisine dayalı amplifikasyon (NASBA), TMA’ya yüzeysel olarak oldukça benzerdir; bununla birlikte, TMA bir izotermal amplifikasyonda iki enzim kullanırken, NASBA üç enzim kullanır. Tescilli bir silika bazlı nükleik asit ekstraksiyon yöntemi kullanılarak nükleik asidin ekstraksiyonundan sonra, ekli bir T7 RNA polimeraz promotörüne sahip bir oligonükleotit primeri, 30 ila 50 yönünde hareket ederek RT etkisiyle uzatılır.
Bir RNAaz enzimi daha sonra RNA zincirini bozar ve ikinci bir primer cDNA molekülüne bağlanır ve RT çift sarmallı DNA molekülünü üretir (tekniğin son yinelemelerinde, DNA zincirinde ters transkripsiyon DNA polimerazı ve RNAaz aktivitesini birleştiren bir enzim kullanılmıştır – TMA tekniğinde olduğu gibi).
T7 polimeraz daha sonra çift sarmallı DNA’dan RNA transkriptleri üretir ve NASBA prosedürü için başka şablonlar olarak görev yapar. Amplikonların tespiti, streptavidin kaplı paramanyetik boncuklara bağlı bir oligonükleotit ve rutenyum etiketli bir prob ile hibridizasyon yoluyla gerçekleştirilir.
Hibritleştirilmiş amplikon-prob kompleksini taşıyan paramanyetik boncuklar, bir mıknatıs vasıtasıyla bir elektrotun yüzeyinde yakalanır. Bu elektrota uygulanan voltaj, bir elektrokimyasal ışıldama reaksiyonunu tetikler. Çok çeşitli hedefler için testler tanımlanmıştır ve son zamanlardaki bir gelişme, bu teknolojide HIV RNA’sının ‘gerçek zamanlı’ tespiti ve nicelleştirilmesine izin veren ‘moleküler işaretçilerin’ kullanılmasıdır.
Tel Yer Değiştirme Amplifikasyonu
İplik yer değiştirme amplifikasyonu (SDA), nükleik asit amplifikasyonu alanında karşılaştırmalı bir yenidir, ancak yaygın olarak kabul görmüştür. SDA yöntemi, DNA polimerazlarının, çift sarmallı bir DNA hedef molekülü içindeki tek sarmallı bir çentikte DNA sentezini başlatma yeteneğine dayanır.
Hedef DNA molekülünün ekstraksiyonu ve denatürasyonunun ardından, hedefe özel bir dizi içeren bir primer oligonükleotit ve bir kısıtlama enzimi tanıma bölgesi (genellikle BsopI) içeren bir dizi, tek sarmallı DNA hedef molekülüne bağlanır.
Bir DNA polimeraz enzimi daha sonra DNA molekülünü kopyalar. Ancak, bu uzama için kullanılan dNTP’ler, -tiyol ikamesi ile değiştirilir. Reaksiyona bir kısıtlama enzimi eklendiğinde, bu, DNA’yı BsopI tanıma bölgesinde kesmeye çalışır, ancak yeni sentezlenen zincir, kısıtlama enziminin yapamadığı, ikameli dCTP içerdiğinden, DNA sarmallarından yalnızca birini kesebilir.
Yeni sentezlenen DNA dizisi böylece yer değiştirir ve primer-DNA dupleksi, yeni bir DNA polimeraz güdümlü kopyalama turu için bir başlatıcı görevi görebilir. Serbest bırakılan kopyalar, reaksiyon için ek bir şablon görevi görebilir. Biriken ürün kemilüminesans yoluyla tespit edilebilir.
DNA polimeraz 1 görevi
DNA replikasyonu
Amplifikasyon Nedir
Rt-PCR Nedir
Replikasyon çatalı
Replikasyon orijini
Komplementer zincir nedir
Amplifikasyon yöntemleri
Sinyal Amplifikasyonu
Dallanmış Zincirli DNA
Nükleik asit saptama ve niceleme için bir “sinyal” amplifikasyon yönteminin bir örneği, ticari olarak temin edilebilen dallı zincirli DNA (bDNA) tahlilinde bulunur. Hepatit B virüs DNA’sını, hepatit C virüs RNA’sını ve insan immün yetmezlik RNA’sını saptamak ve ölçmek için üç ürün mevcuttur.
HIV RNA’sının saptanması için kullanılan yöntem, insan plazmasında HIV-1 RNA’nın doğrudan nicelenmesi için bir sandviç nükleik asit hibridizasyon prosedürüdür. HIV-1 önce santrifüjleme yoluyla plazmadan konsantre edilir. Daha sonra viryonlardan RNA’yı serbest bırakmak için tescilli bir nükleik asit ekstraksiyon prosedürü kullanılır.
RNA, bir dizi spesifik, sentetik oligonükleotid yakalama probu tarafından bir mikro kuyucukta yakalanır. Bir dizi hedef probun daha sonra hem viral RNA’ya hem de pre-amplifikatör problarına hibritleşmesine izin verilir. 17 ayrı yakalama genişletici içeren yakalama probları ve 81 ayrı hedef genişletici içeren hedef problar, viral RNA’nın pol geninin farklı bölgelerine bağlanır.
Amplifikatör probu, dallanmış bir DNA (bDNA) kompleksi oluşturarak ön amplifikatöre hibridize olur. Alkali fosfataz (AP) etiketli bir probun çoklu kopyaları daha sonra bu hareketsizleştirilmiş komplekse hibridize edilir. Tespit, kompleksin kemilüminesan bir substrat ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir.
Işık emisyonu, her numunede bulunan HIV-1 RNA miktarı ile doğrudan ilişkilidir ve sonuçlar, bir luminometre analizörü tarafından bağıl ışık birimleri (RLU’lar) olarak kaydedilir. Standart bir eğri, bilinen virüs konsantrasyonlarını içeren standartlardan gelen ışık emisyonu ile tanımlanır. Örneklerdeki HIV-1 RNA konsantrasyonları bu standart eğriden belirlenir.
Hibrit Yakalama
Ticari olarak temin edilebilen bir başka sinyal amplifikasyonu, bDNA yönteminden daha sınırlı hassasiyet sunar. Hibrit yakalama yöntemi, hedef DNA’yı serbest bırakmak için numunenin bozulmasını içerir. DNA daha sonra solüsyondaki spesifik RNA probları ile birleştirilir ve DNA-RNA hibritleri, DNA-RNA hibritlerine özgü monoklonal antikorlar kullanılarak bir mikrotitre plakası veya reaksiyon tüpü üzerinde yakalanır.
Yakalanan melezler, alkalin fosfataza konjuge edilmiş çoklu antikorlar kullanılarak saptanır. Bağlı alkalin fosfataz, bir dioekstan substrat ile kemilüminesan bir reaksiyonla tespit edilir.
Prob Amplifikasyonu
Ligaz Zincir Reaksiyonu
Ligaz zincir reaksiyonu (LCR), iki tamamlayıcı oligonükleotit prob dizisinin bir hedef DNA’ya bağlanmasını içerir (nükleik asidin viriondan ekstraksiyonu ve DNA’nın denatürasyonunun ardından). Hedef moleküle hibridize edildikten sonra iki çift tamamlayıcı sondayı birleştirmek için bir DNA ligaz enzimi kullanılır.
Reaksiyon, DNA zincirlerini ayırmak için ısıtılır ve iki tek sarmallı DNA dizisi, daha fazla prob bağlanması için şablonlar oluşturur. Yöntem, prob duplekslerinin kör uç ligasyonu nedeniyle yüksek arka plan ile bir şekilde sınırlıdır ve spesifik olmayan prob bağlanmasını azaltmak için hibridizasyon koşullarının oldukça katı olması gerekir.
Yine de teknik, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoea, mikobakteriler ve Borrelia spp içerir.
Ancak son zamanlarda, bu teknolojinin ticari sağlayıcıları, mikrobiyal hedeflerin saptanmasına yönelik bir PCR yaklaşımı lehine prosedürü terk etmeye başlamış gibi görünmektedir.
Dizi Analizi
Bir virüsün nükleik asit dizisinin belirlenmesi, klinik virolojide önemli pratik uygulamalara sahiptir. Virüsün hücre kültürü izolasyonunun kullanımı, daha hızlı virüs tanımlama yöntemleri (viral antijenlerin doğrudan tespiti veya viral nükleik asitlerin tespiti gibi) lehine azaldığından, dolaşımdaki virüsle ilgili epidemiyolojik bilgi miktarında bir azalma olmuştur.
Amplifikasyon Nedir Amplifikasyon yöntemleri DNA polimeraz 1 görevi DNA replikasyonu Komplementer zincir nedir Replikasyon çatalı Replikasyon orijini Rt-PCR Nedir