DA–DAPI Bantlama
Kromozomlar flüoresan boya 4,6-diamino-2-fenil-indol (DAPI) ile boyandığında ve flüoresan olmayan karşı boya distamisin (DA) ile işlendiğinde, flüoresan C-bantlarının bir alt kümesi ortaya çıkar. 1, 9, 16 ve Y kromozomlarının heterokromatik bölgeleri ve 15. kromozomun proksimal kısa kolu çok parlak bir şekilde floresandır. Tek başına DAPI kullanmak, Q-bantlamaya benzer bir bantlama modeli üretir.
Mekanizma
DAPI, DNA’ya bağlanır ancak AT baz çiftleri için bir afiniteye sahiptir. Tek başına DAPI bağlanması bu nedenle zayıf bir Q-bantlama modeli verir. DAPI floresansı hem AT hem de GC baz çiftleri tarafından arttırılsa da, AT açısından zengin DNA bölgelerinde floresanda önemli bir artış vardır.
DAPI’nin DNA çift sarmalının küçük oluğundaki AT kümelerine bağlandığına dair bazı kanıtlar da vardır. DA ayrıca AT’ye özgü DNA bağlanma afinitesini de gösterir. Kullanılan iki boya benzer baz çifti tercihine sahip olsa da, bunlar özdeş olmayan bağlanma afinitelerine ve farklı yapılara sahiptir.
Elde edilen diferansiyel floresan, benzer fakat aynı olmayan bölgelerde bağlanan iki boya arasındaki rekabetçi bağlanmadan kaynaklanabilir. Alternatif olarak, DA ökromatik bölgelerde DAPI bağlanmasını bloke edebilirken, DAPI bağlanma bölgeleri heterokromatik bölgelerde kullanılabilir durumda kalır.
Uygulamalar
DA/DAPI bantlaması ağırlıklı olarak daha rutin bantlama yöntemleri (G- veya R-bantlama) kullanılarak tespit edilen belirli kromozom anormalliklerinin yorumlanması için kullanılır, örn. DA/DAPI bantlaması, yapısal olarak yeniden düzenlenmiş bir kromozomun, DA/DAPI bantlaması ile seçici olarak boyanmış bir bölgeye yakın bir kesme noktasına sahip olduğu durumlarda kullanılabilir. DA/ DAPI bantlaması, özellikle küçük uydulu markör kromozomlarını incelemek için kullanışlıdır.
Bu teknik, kromozom 15’in proksimal ucunu içeren işaretçi kromozomları tanımlayabilir. DAPI boyama, kromozom preparatlarının rutin floresan in situ hibridizasyonu için en yaygın olarak kullanılan karşı boyamadır.
Kromozom bantlama teknikleri
HRB Bantlama
Kromozom bantlama yöntemleri pdf
G bantlama temel prensibi
G Bantlama boyama metodu
G Bantlama yöntemi
G Bantlama Protokolü
Kromozom Bantlama ne demek
Çoğaltma Bantlama
Timidin analoğu 5-bromo-2-deoksiüridin (BrdU) varlığında büyütülürlerse ve floresan boya Hoechst 33258 ile boyanırlarsa, kromozom preparasyonları üzerinde bir G- veya R-bantlama modeli üretilebilir. kromozomun farklı bölgelerinin S fazı sırasında farklı aşamalarda replike olması gerçeği vardır.
Bu yöntem, etiketin DNA’ya dahil edilmesine dayanır, bu nedenle doku kültüründe canlı hücrelere BrdU eklenir. BrdU darbesinin hasat süresine göre hücre kültürlerine ne zaman uygulandığının zamanlamasını kontrol ederek, erken veya geç replikasyon bantlama modeli üretilebilir. BrdU kültür başlangıcında eklenir, ancak hasattan yaklaşık 6 saat önce 48 saatte çıkarılırsa, bir G-bantlama modeli elde edilir.
BrdU kültürler hasat edilmeden sadece 6 saat önce eklenirse, R-bantlama sonuçları. BrdU varlığında hücreler iki tam replikasyon döngüsüne maruz kalırsa, her kromozomun kardeş kromatidleri farklı şekilde boyanır.
Elde edilen harlikinizasyon paterni, kromatit materyalinin kardeş kromatitler arasında değiş tokuş edildiği kromozomların uzunluğu boyunca noktalar olan kardeş kromatit değişimlerinin (SCE’ler) saptanmasını sağlar. SCE preparatları florokrom Hoechst 33258 ile boyanmıştır.
Daha sonra ya floresan mikroskobuyla (360-400 nm) incelenirler ya da önce UV ışığına maruz bırakılırlar ve ardından Giemsa boyası [Floresan Artı Giemsa (FPG) boyaması] ile boyanırlarsa, ışık mikroskobu kullanılarak analiz edilebilirler.
Mekanizma
BrdU, kromozomlara kolayca dahil olan bir timidin analoğudur. Kromozomlar (AT bakımından zengin baz çiftlerine bağlanan) florokrom Hoechst 33258 ile boyandığında, BrdU varlığında çoğalan kromozom bölgeleri BrdU ile sübstitüe edilmiş DNA içerir.
BrdU, kültür başlangıcında mevcut olduğunda, bir DNA replikasyonu döngüsünün erken kısmı için mevcuttur ve bu nedenle S fazında (R-bantları) erken replike olan kromozom bölgeleri BrdU- ikame edilir ve bu nedenle zayıf flüoresanslı veya ışık boyamalıdır.
G-bantları, BrdU kültürlerden çıkarıldıktan sonra S fazında geç çoğalır ve bu nedenle timidin içerir ve parlak floresandır veya Giemsa (G-bantlaması) ile koyu boyanır.
Alternatif olarak, BrdU kültürlere hasattan yaklaşık 6 saat önce eklenirse, yalnızca bir DNA replikasyon döngüsünün geç kısmı için mevcuttur ve erken replikasyon bölgeleri (R-bantları) zaten replike olmuş, timidin ve Giemsa ile parlak floresan ya da koyu lekeli. Yalnızca geç kopyalanan bölgeler (G-bantları) BrdU ile ikame edilir ve bu nedenle zayıf flüoresans verir veya Giemsa (R-bantlaması) ile hafifçe lekelenir.
Homolog kromozomlar benzer replikasyon paternleri gösterse de, kadınlarda erken ve geç replikasyon X kromozomları ayırt edilebilir. Geç replikasyon yapan X kromozomu, erken puls BrdU replikasyon bandı ile daha koyu boyama ve geç pals BrdU replikasyon bandı ile daha açık boyamadır.
BrdU, iki replikasyon döngüsü için hücre kültürlerinde mevcut olduğunda elde edilen harlikinize boyama modeli, BrdU’nun kromozomal DNA’ya asimetrik dahil edilmesini yansıtır. Yarı korunumlu replikasyonla, her yeni DNA dizisi, bir orijinal DNA zincirinden ve bir yeni oluşturulmuş diziden oluşur.
BrdU mevcudiyetinde iki replikasyon döngüsünden sonra, bir kromatit, bir DNA zincirinde ikame edilmiş BrdU ile DNA içerirken, kardeş kromatidi iki BrdU ikameli DNA zinciri içerir. Kardeş kromatitler arasındaki bu kimyasal fark, elde edilen boyama yoğunluğundaki farkı açıklar.
Boyama yoğunluğu, her kromatitte bulunan timidin içeren DNA miktarı ile orantılıdır. Kromozom preparasyonları floresan artı Giemsa yöntemi kullanılarak boyandığında, çift yönlü BrdU-ikameli kromatitten, karşılığına göre daha fazla DNA kaybedilir ve böylece karakteristik harlikinize boyama modeli üretilir.
Uygulama
G- ve R-bantlama için alternatif yöntemler sağlamanın yanı sıra, hücre döngüsünün erken veya geç bir döneminde bir BrdU darbesi uygulandıktan sonra elde edilen boyama desenleri esas olarak replikasyon çalışmaları için kullanılır. Normal dişilerde her hücrede rastgele bir süreçle bir X kromozomu inaktive edilir ve bu inaktive edilmiş X her zaman her hücre döngüsünde replikasyonunu tamamlayan son kromozomdur.
Replikasyon bantlaması, X kromozomunu içeren yapısal anormallikler taşıyan dişilerde X inaktivasyonu paternini araştırmak için yararlıdır, burada X inaktivasyonu paterninin genellikle rastgele olmayan bir olay olduğu bulunur.