Hangi anti-DNA testi seçilmeli?
İdeal tahlil, hastalık aktivitesini güvenilir bir şekilde yansıtmanın yanı sıra, lupus tanısı için yeterince duyarlı ve spesifik olmalıdır. Açıklanan üç testin tümü, aktif hastalığı olan hastalarda >%90 duyarlılıkla birinci kriteri karşılar. Özgüllük açısından, Crithidia ve Farr testleri (özgüllük >%90) ELISA'dan üstündür.
ELISA tahlillerinin, düşük aviditeli antikorları saptama eğilimleri nedeniyle, lupusu olmayan hastaların önemli bir azınlığında yanlış pozitif DNA antikoru sonuçları ürettiği bilinmektedir. Bu dezavantaja rağmen, ELISA tahlilleri, yüksek hassasiyetleri, otomasyon kolaylığı, sonuçları güvenilir bir şekilde nicelleştirme yetenekleri (seri izleme için faydalıdır) ve tahlilde radyoizotop eksikliği nedeniyle klinik uygulamada giderek daha fazla kullanılmaktadır.
Farr testi, hastalık izleme için eşit derecede uygundur ve özellikle böbrekleri içeren hastalık alevlenmelerinin gelişimini öngörmede gerçekten ELISA'dan üstün olabilir.
Yakın zamanda yapılan bir randomize Hollanda çalışmasında, immünosupresif tedavide önleyici artışlar alan anti-dsDNA seviyelerinde %25 artış olan hastalarda, konvansiyonel olarak tedavi edilen kontrol grubuna kıyasla nükslerde önemli bir azalma olmuştur (Bootsma ve ark.).
Lupus hastalarının küçük bir kısmı, DNA antikorlarında eşlik eden bir artış olmaksızın nüks edebilir; benzer şekilde, her üç testte de sürekli olarak yüksek antikor seviyeleri bulunmasına rağmen hastaların az bir kısmı klinik olarak stabil veya asemptomatik olabilir.
Lupus ve Antifosfolipid Sendromu
Fosfolipidlere (APA) karşı antikorlar, tromboz belirteçleri olarak işlev görür ve lupuslu hastaların üçte birinde görülür. 'Antifosfolipid sendromu' (APS) terimi, trombozu ve yüksek fosfolipid antikor seviyeleri olan hastaları tanımlamak için kullanılmıştır. Ağırlıklı olarak venöz trombozla sonuçlanan diğer trombofilik durumların aksine, APS'li hastalarda hem arteriyel hem de venöz damarlarda tromboz gelişebilir.
Klinik belirtiler, hangi organın iskemiye dönüştüğüne bağlıdır. APA, ELISA ile veya fosfo-lipid bağımlı pıhtılaşma tahlillerinin (aktive kısmi tromboplastin zamanı-APTT) uzatılmasıyla saptanabilir.
Asidik bir fosfolipid olan kardiyolipin kullanılarak antijen olarak ELISA ile saptanan APA, enfeksiyon (bakteriyel, viral, protozoal), ilaç tedavisi ve diğer bağ dokusu hastalıkları olan hastalarda birçok yanlış pozitif tanımlandığından, her zaman gerçek bir tromboz belirteci olarak hareket etmeyebilir. Aslında, geçmişteki yanlış pozitif VDRL, VDRL'de bulunan kardiyolipin'e yönelik APA'nın varlığından kaynaklanmaktadır.
Mevcut ELISA testlerinin trombozla ilişkili ve trombozla ilişkili olmayan APA arasında ayrım yapamaması, yüksek APA düzeylerinin klinik önemini yorumlamada zorluklara yol açmıştır.
Antifosfolipid sendromu belirtileri
antifosfolipid sendromu - ekşi
Antifosfolipid sendromu bitkisel tedavisi
Antifosfolipid sendromu gebelik
Sekonder antifosfolipid sendromu
Antifosfolipid sendromu Kadınlar Kulübü
Antifosfolipid sendromu laboratuvar
Antifosfolipid sendromu tanı kriterleri
Bu ayrım önemlidir, çünkü trombozla ilişkili APA'lı hastalar, muhtemelen ömür boyu yoğun, uzun süreli antikoagülan tedaviye ihtiyaç duyarlar. Son kanıtlar, trombozla ilişkili APA'nın, kendi başına fosfolipidlerden ziyade büyük ölçüde 2 glikoprotein I'e (2GPI, fosfolipitleri bağlayan bir serum protein ko-faktörü) yönelik olduğunu göstermektedir.
Mevcut tahlillerde iki 2GPI kaynağı bulunur: ELISA plakalarını bloke etmek için kullanılan insan serumu test numuneleri ve sığır serumu. 2GPI ile immobilize kardiyolipinin etkileşiminin, konformasyonunu değiştirerek immünojenik hale getirdiği düşünülmektedir.
Konvansiyonel ELISA tahlillerinin trombozla ilişkili ve trombozla ilişkili olmayan APA arasında ayrım yapamaması nedeniyle, antijen olarak saflaştırılmış 2GPI kullanan tahlillere büyük ilgi vardır. Varlıkları şu anda antifosfolipid sendromu için tanı kriterlerine dahil edilmemesine rağmen, anti-2GPI antikorları, ELISA ile saptanan geleneksel kardiyolipin antikorlarından daha güçlü tromboz öngörücüleridir.
Fosfolipid bağımlı pıhtılaşma deneylerine müdahale eden APA, bir fosfolipid-protrombin kompleksini tanır ve lupus hastalarında ortaya çıktıklarından dolayı lupus antikoagülanları (LAC) olarak adlandırılır. LAC terimi, kanamadan ziyade in vivo tromboz ile ilişkili olduğu için yanlış bir isimdir.
Normal plazmanın eklenmesiyle düzelmeyen uzamış bir APTT'den LAC'nin varlığından şüphelenilir, bu da bir inhibitörün varlığını düşündürür. LAC antikorlarının gösterilmesi, pıhtılaşmanın işlevsel düzensizliğini gösterdiğinden, bu antikorlar, ELISA tarafından gösterilen APA'ya göre tromboz ile daha yakından ilişkilidir.
Lupuslu hastaların çoğunda kardiyolipin antikorlarının yanı sıra LAC (%70) olacaktır, ancak hastaların az bir kısmında kardiyolipin antikorları veya LAC (her kategoride %15) olacaktır.
Nöropsikiyatrik sistemik lupus eritematozus (NPSLE)
Laboratuvar araştırmasının rolü
SLE'de nörolojik tutulum, hastalıklarının bir noktasında hastaların üçte ikisini etkileyen önemli bir sorundur. Bu tür hastaların yaklaşık %20'si bunu aktif sistemik hastalık zemininde yaparken, vakaların çoğunda sistemik hastalık sessizdir veya sadece hafif derecede aktiftir.
SLE ve nörolojik özellikleri olan bir hastayla karşı karşıya kalan hekim, doğrudan lupus (birincil) nedeniyle nörolojik hastalık, ikincil neden olarak fırsatçı enfeksiyon ve steroid psikozu arasında önemli bir ayrım yapmalıdır, çünkü çoğu hasta o sırada immünosupresif tedavide olacaktır. sunumun.
Altta yatan çok sayıda patojenik mekanizmayı yansıtan çok çeşitli klinik sunumlar görülmektedir. Çeşitli klinik sunumları açıklamak için en az üç hipotez öne sürülmüştür: anti-nöronal antikorlar, fosfolipid antikorlarla ilişkili tromboz ve sitokin kaynaklı hastalıktır.
Ne yazık ki, şu anda mevcut olan SLE laboratuvar belirteçlerinin hiçbiri birincil nörolojik lupus tanısı için yeterince spesifik değildir. Birkaç çalışma, serum veya beyin omurilik sıvısındaki (BOS) anti-DNA ve kompleman (C3, C4) düzeylerindeki anormalliklerin, SLE'de nörolojik ve nörolojik olmayan hastalık arasında ayrım yapmadığını göstermiştir.
Nöronlara (beyin dokusu ile çapraz reaksiyona giren lenfositotoksik antikorlar ve doğrudan nöronal antijenlere karşı hedeflenen antikorlar) karşı yönlendirilen antikorlar için başlangıçtaki istek, nörolojik tutulum olmayan lupus hastalarında varlıklarını gösteren çalışmalarla, nörolojik lupus için spesifik belirteçler olarak azaltılmıştır.
Aynı şekilde, ribozomal P proteinlerine karşı yönlendirilen antikorların, lupus psikozunun spesifik belirteçleri olduğu yönündeki son iddialar, psikozu olmayan SLE hastalarının %50'ye varan kısmında gösterilerek çürütülmüştür.
NPSLE gibi görünen enfeksiyon vakalarının teşhis edilebilmesi için tüm nöropsikiyatrik SLE hastalarında BOS muayenesi zorunludur. SLE'de nörolojik tutulumla ilgili yakın tarihli bir prospektif çalışmada, vakaların yaklaşık %50'sinde altta yatan neden enfeksiyon (kriptokok, tüberküloz ve piyojenik menenjit) olmuştur.
Yalnızca BOS'ta oligoklonal bantların varlığı birincil NPSLE'yi destekler ancak enfeksiyonla da ortaya çıkabilir. Spesifik bir laboratuvar belirtecinin yokluğunda, NPSLE tanısı büyük ölçüde geleneksel klinik sezgiye bağlı kalır.
Bileşiklerin Saflaştırılması
Bu çalışmada uygulanan ABS, ortak kolinyum katyonunu klorür, bikarbonat, dihidrojenkitrat, asetat ve dihidrojen fosfat gibi birkaç anyonla birleştiren IL’lere dayanıyordu. Araştırılan IL’lerin kimyasal yapıları Şekil 5.4’te gösterilmektedir. Polietilen glikol (PEG 600), faz ayrılmasını ve ABS oluşumunu desteklemek için kullanıldı.
Yazarlar, iyi huylu ve biyouyumlu özelliklerine dayalı olarak kolinyum bazlı IL’lerin seçimini haklı çıkardılar ve bu nedenle, daha fazla insan tüketimi için bir antibiyotiğin geri kazanılmasında uygulanabilirliğini desteklediler. Ek olarak, bu IL’ler kolay hazırlanır, nispeten ucuzdur, suda stabildir ve biyolojik olarak parçalanabilir.
Tetrasiklin bölümlemesinin optimizasyonu, kolinyum bazlı IL’lerin farklı konsantrasyonlarının test edilmesiyle elde edildi [26]. Çoğu durumda, tetrasiklin tercihli olarak PEG’den zengin faza geçer ve bu göç modelinden IL’nin tuzlama kapasitesinin sorumlu olduğu sonucuna götürür.
Bağlantı hattı uzunluğunun etkisi de araştırılmış, ancak ayrılma katsayısı ile bu parametre arasında kolinyum bikarbonat içeren sistem dışında doğrudan bir ilişki algılanmamıştır.
Tetrasiklin amfoterik bir ilaç olduğu için ilaç bölüşümü üzerindeki pH etkisi de incelenmiş ve önemi kanıtlanmıştır. Saflaştırılmış fermente et suyundan kolinyum bazlı IL’ler kullanılarak tetrasiklin ekstraksiyonunda en yüksek bölme katsayısı, kolinyum bikarbonat ve PEG 600’den oluşan ABS ile elde edilmiştir.
Bu sonuçlar, PEG / Na2SO4 ve [Ch] Cl / K3PO4 bazlı ABS kullanılarak elde edilenlerle karşılaştırıldı. En yüksek bölme katsayıları [Ch] Cl (ağırlıkça% 20.1) C K3PO4 (ağırlıkça% 35.02) içeren sistem için elde edildi.
Bununla birlikte, tetrasiklinin tercihli göçü üzerinde bazı tersine dönmeler gözlendi, bu da yazarların [26] antibiyotiğin geri ekstraksiyonunu ve her iki fazın geri dönüşümünü önermesini sağladı.
Ortamın pH’ına bölümleme bağımlılığı, tetrasiklinin geri ekstraksiyonunu tetiklemek için kullanılabilir (türleşmesi nedeniyle). Örneğin, PEG 600 / Na2SO4 ABS’de tetrasiklin esas olarak nötr formundadır (5.30 <pH <6.25), oysa [Ch] Cl / K3PO4 sisteminde tamamen protondan arındırılmıştır (fazların pH’ı> pKa3).
Bu nedenle, polimer-tuz sisteminde, tetrasiklin 18 sırasındaki K değerleri ile üst fazda (PEG açısından zengin faz) geri kazanılırken, [Ch] Cl / K3PO4 sisteminde, antibiyotik tercihli olarak [Ch ] Cl bakımından zengin faz (K 46 ile). Bu sonuçların bir özeti Şekil 5.5’te verilmektedir.
Liu ve arkadaşları, penisilin G’nin fermentasyon sıvısından ekstrakte edilmesi / saflaştırılması hakkında dört makale [27-30] sundu. Penisilin elde etmenin geleneksel yolu, düşük pH’ta organik çözücülerle ekstraksiyonu, yüksek pH’ta sulu bir faza geri ekstraksiyonu ve saf ürünün kristalizasyonunu içerir.
Bununla birlikte, fermentasyon sıvısında proteinlerin varlığından kaynaklanan emülsifikasyon ve düşük pH değerlerinde penisilinin ayrışması, bu teknolojinin başarısını ciddi şekilde engellemektedir.
Saflaştırma Yöntemleri
Ayırma ve saflaştırma Teknikleri
Ekstraksiyon
Karışımları ayırma Yöntemleri
Ekstraksiyon örnekleri
Kristallendirme nedir
Kristallendirme ile ayrımsal kristallendirme arasındaki fark
Kristallendirme örnekleri
Birkaç IL’nin test edildiği önceki çalışmanın aksine, Liu ve ark. ABS’yi uygulamak için bir IL, yani [C4mim] [BF4] ve bir inorganik tuz olan NaH2PO4’ü seçti ve IL’nin, inorganik tuzun ve penisilin konsantrasyonunun ilaç ekstraksiyon etkinliği ve bölme katsayısı üzerindeki etkisini araştırdı. 4 ile 5 arasındaki bir pH’ta sulu çözeltiden penisilin G’nin ekstraksiyonunda% 93.7’lik yüksek bir ekstraksiyon verimi elde edildi.
Yazarlar, bu yeni yöntemin penisilinin bozulmasına yol açmadığını ve emülsifikasyon ve protein denatürasyonunun meydana gelmediğini belirtmişlerdir.
Daha sonra, doğrudan endüstriyel imalat tarafından sağlanan filtrat fermantasyon et suyundan penisilin ekstraksiyonu gerçekleştirildi. PH D 5.8-6.0’da 20.000 ve 30.000 / mL penisilin G grupları, [C4mim] [BF4] (ağırlıkça% 20) C NaH2PO4 (ağırlıkça% 40) içeren bir ABS ile optimize edilmiş koşullarla birlikte kullanıldı ve% 90 civarında bir ekstraksiyon verimi elde edildi.
ABS’nin IL bakımından zengin fazında penisilin G geri kazanılmış ve karşı katmanda çeşitli proteinler bırakılmıştır. Daha sonra, hidrofobik 1-butil-3-metilimidazolyum heksaflorofosfat ([C4mim] [PF6]), [C4mim] [BF4] zengin faz ile karıştırılarak iki yeni fazın oluşmasına yol açtı: her ikisi açısından zengin bir hidrofobik faz IL’ler ve su ve penisilin G açısından zengin bir hidrofilik fazdır.
Araştırılan IL’lerin kimyasal yapıları ve tanımları Şekil 5.2’de verilmiştir. Geleneksel sıvı-sıvı bütil-asetat-su sistemi veya polimer bazlı ABS ile karşılaştırıldığında, IL-bazlı ABS iki ana avantaj gösterdi: penisilin, protein emülsifikasyonundan kaçınırken nötr pH’da verimli bir şekilde ekstrakte edilir ve IL, geri dönüştürülebilir.
Bununla birlikte, [C4mim] [BF4] sulu asidik çözeltilerde kararsız olduğundan, sonraki bir çalışmada Liu ve ark. 1-butil-3-metilimidazolyum klorür ([C4mim] Cl) C NaH2PO4’ten oluşan yeni bir ABS’yi test etti. Yine IL, tuz ve penisilin konsantrasyonları, penisilin için maksimum ekstraksiyon verimlerini ve bölme katsayılarını tetiklemek için değerlendirildi.
Başka bir çalışmada Liu ve ark. penisilin G’nin enzimatik hidrolizinde önceki prosedürün uygulanmasını inceledi, 6-aminopenisillanik asit ve bir yan ürün olan fenil asetik asit elde etti.
Penisilin asilaz ile penisilin G hidrolizi, IL bakımından zengin katman ile dengede su bakımından zengin fazda gerçekleşir ve 6-aminopenisillanik asit, üretilirken çalışma pH’ı D5’te uygun şekilde çökelirken, fenil asetik asit, IL açısından zengin fazdır.
Sonuç olarak, iki ürünün enzim ortamından nispeten yüksek pH değerlerinde uzaklaştırılmasına, hem enzimatik aktivite hem de stabilite için yararlı olan bu yerinde ürün geri kazanım yaklaşımında izin verilir.
Farmasötik bileşiklere olan ilgiye ek olarak, enzimlerin hücre dışı ortamdan sulu bifazik sistemler kullanılarak ekstraksiyonuna özel bir odak verilmiştir. Makromolekülleri saflaştırmak için geleneksel yöntemler, amonyum sülfat çökeltme, diyaliz, iyonik ve afinite kromatografisi veya elektroforez gibi birkaç adımı içerir.
Bu metodolojiler enzim üretiminin maliyetini artırır ve büyük ölçekte uygulanması zordur. Son yıllarda, sıvı-sıvı özütleyici biyo-dönüştürme işlemleri, özellikle ABS, enzimleri ve diğer biyolojik olarak aktif makromolekülleri özütlemek ve saflaştırmak için büyük bir potansiyel göstermiştir.
Aşağıda açıklanan her iki çalışmada da, doğrudan kaynaklı toksisite ve biyouyumluluk sorunlarından kaçınmak amacıyla, üretim aşamasının bitiminden sonra fermantasyon broth’u kullanılarak ayırma ve saflaştırma aşamaları gerçekleştirildiğinden dolaylı bir ISPR yaklaşımının gerçekleştirildiğini belirtmek gerekir.
Bu aynı zamanda IL toksisitesi hakkında bilgi eksikliğinin bir sonucudur ve araştırılması gereken bir alanı gösterir. İyi çalışılmış imidazolyum bazlı sıvılara ek olarak, günümüzde çok sayıda IL’nin mevcut olduğu ve daha biyouyumlu IL’lerin kullanıldığı çalışmaların hayati önem taşıdığının altı çizilmelidir.
