Blog

Ters faz modu, kimyasal olarak sentezlenmiş oligonükleotitleri, gerekli oligonükleotit üzerinde kasıtlı olarak kararsız bir lipofilik koruma grubu bırakarak saflaştırmak için kullanılabilir; bu, böylece güçlü bir şekilde tutulur ve daha polar reaksiyon yan ürünlerinden ayrılabilir. Daha sonra, lipofilik koruma grubu kimyasal olarak uzaklaştırılarak doğal yapı yeniden oluşturulabilir. Ters Fazlı İyon Çifti HPLC Ters fazlı iyon çifti kromatografisinde, oligonükleotitlerin fosfat grupları üzerindeki negatif yükler, pozitif yüklü alkilamonyum iyonlarının eklenmesiyle nötralize edilir ve ODS durağan fazlarında kromatografi gerçekleştirilebilir. Bu yöntem yaygın olarak kullanılmamıştır, ancak bir fosfodiesteraz ile ilk enzimatik sindirimden sonra oligonükleotitlerin zincir uzunluğunun belirlenmesi için kullanılmıştır. Boyut Dışlama HPLC Genel olarak, yüksek performanslı boyut dışlama kromatografisi, iyon değişim veya ters faz modlarına kıyasla düşük çözme gücü nedeniyle 100'den az baz içeren oligonükleotitlerin ayrılması için kullanılmaz. Bununla birlikte, transfer RNA'lar, ribozomal RNA'lar ve DNA kısıtlama fragmanları gibi çok daha büyük moleküllerin ayrılması için boyut dışlama kullanılır, ancak bu ayırmalar için genellikle poliakrilamid jel elektroforezi tercih edilir. Proteinler, peptidler ve amino asitler HPLC, son on yılda protein kimyası alanında muazzam bir etki yarattı ve özellikle bu konuya adanmış yıllık bir konferans başlatıldı. Bu süre boyunca, büyük proteinlerin (> 20 kDa) hem ters faz hem de iyon değişim kromatografisi için ticari olarak temin edilebilen sabit fazlar tanıtıldı, ancak bunların uygulamalarının tam kapsamı gerçekleştirilmeyi bekliyor. HPLC'nin proteinlere uygulanmasına ilişkin çeşitli incelemeler yayınlanmıştır. Proteinler Proteinlerin kromatografisine olan son ilgi, rekombinant DNA teknolojisindeki gelişmeler tarafından belirgin bir şekilde uyarılmıştır. Bu gelişmeler, proteinlerin yapısının ayrıntılı çalışmalarını (terapötik potansiyelin bir kısmı) kolaylaştırmış ve biyolojik aktiviteyi değiştirmek için yapıyı yeniden tasarlama olasılığını ortaya çıkarmıştır. X-ışını kristalografisi veya iki boyutlu NMR kullanılarak detaylı bir analiz için yüksek derecede saflaştırılmış protein preparatları gereklidir. Proteinlerin saflaştırılması geleneksel olarak zor, zahmetli ve zaman alıcı bir iş olarak görülmüştür. Bunun nedeni, iki proteinin aynı yöntemle aynı derecede saflaştırılamaması ve sonuç olarak her saflaştırma işleminin ampirik olarak türetilmesi gerekmesidir. Aşağıdaki bölüm, proteinlerin saflaştırılması için HPLC'yi düşünen veya halihazırda kullanmakta olan araştırmacılar için bir kılavuz olarak tasarlanmıştır ve saflaştırma için başarılı bir strateji tasarımı için kılavuzlar sağlar. Arındırma yöntemleri Nelerdir KBRN arındırma yöntemleri Kbrn Ünitesi ne demek Arındırma Yöntemleri KBRN Dekontaminasyon Ünitesi STANDARTLARI KBRN müdahale Basamakları KBRN talimatı KBRN ünitesi YÖNETMELİĞİ Arındırma Yöntemleri Fizikokimyasal yönler Saflaştırma stratejileri genellikle proteinlerin fizikokimyasal yönlerinden, yani boyutlarından, yüklerinden ve hidrofobikliklerinden yararlanan bir ayırma yöntemlerinin kombinasyonuna dayanır. Mümkünse, organik çözücü veya asit kullanarak ilk ekstraksiyon faydalı olabilir, ancak denatürasyon ve modifikasyondan (örneğin, glutamin ve asparaginin deaminasyonu) kaçınmak için özen gösterilmelidir. Başlangıçta boyut dışlama kromatografisi kullanarak numuneyi fraksiyonlara ayırmak protein saflaştırmada yaygın bir uygulamadır; ancak bu, numune hacmini artırma dezavantajına sahiptir ve bu nedenle hazırlık ölçeğinde bu prosedür ilk aşama olarak önerilmemektedir. Daha kullanışlı bir strateji, numuneyi konsantre etmek için bir başlangıç ​​adsorpsiyon adımı kullanmaktır; bu, proteinlerin nanomol miktarlarıyla uğraşırken, sonraki adımların geliştirilmesi için bir önkoşuldur. Sonraki aşamaların geliştirilmesi için yeterli miktarlarda protein biriktirmek için yeterince uzun süre boyunca proteinin kararlı bir biçimde tutulmasına izin veren bir ara aşama geliştirmek de önemlidir. İyon değişim kromatografisi tekniği, proteinlerin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü kromatografik koşullar çoğu proteinin stabilitesiyle uyumludur. Ayrıca, numune kapasitesi yüksektir ve seçicilik, diğer herhangi bir kromatografik modda olduğundan daha iyidir. Ayırma işlemleri, yüksek pH değerlerinde (anyon değiştirme) veya düşük pH değerlerinde (katyon değiştirme) gerçekleştirilebilir. Numune, mobil fazın pH'ının değiştirilmesi veya daha yaygın olarak iyonik kuvvetin arttırılmasıyla ayrıştırılabilir. İyon değişimli bir durağan fazda bir proteinin davranışı bazen iki boyutlu izoelektrik odaklanma tekniği kullanılarak tahmin edilebilir. Bu teknik, hidrofilik proteinler için iyi çalışır, ancak daha hidrofobik proteinlerin kromatografik davranışı, izoelektrik odaklamada bir elektrik alanın etkisi altında görülenden oldukça farklı olabilir. Mobil faza (10-208) düşük konsantrasyonda bir organik çözücünün dahil edilmesi, iyon değişim kromatografisinde yaygın bir prosedürdür ve numunelerle uğraşırken yüksek konsantrasyonlarda üre (3-6 M) kullanımı da popülerdir. sulu ortamda idareli çözünür olan, ancak ikincisi lizin ve muhtemelen sistein kalıntılarının modifikasyonuna neden olabilir. Yeni iyon değiştirici sabit fazların mevcudiyeti, örn. polimer bazlı (TSK-PW, Toyo Soda; FPLC, Pharmacia) ve çeşitli silika bazlı sabit fazlar (Synchrom, Brownlee), bu tekniği analitik ve preparatif HPLC için kullanılabilir hale getirir. İyon değiştirme kromatografisinden sonra, numune genellikle yüksek tuz konsantrasyonu içeren mobil faz. Geleneksel olarak tuz, amonyum sülfat kullanılarak çökeltme ve ardından diyaliz yoluyla uzaklaştırılmıştır. Bununla birlikte, numune ayrıca doğrudan bir hidrofobik sabit faza da uygulanabilir ve su veya polioller kullanılarak ayrıştırılabilir; ters fazlı sabit fazlar (geniş gözenekli silika bazlı) veya hidrofobik sabit fazlar (TSK-PW, fenil) bu amaç için idealdir. Boyut dışlama kromatografisi daha sonra mobil fazı uçucu olan ve bu nedenle liyofilizasyon için uygun olana dönüştürmek veya diğer istenmeyen düşük moleküler ağırlıklı kontaminantları çıkarmak için kullanılabilir. Bu ayırma yöntemlerinin bir kombinasyonu hala çok sık olarak mevcut olan tek yaklaşımdır; bununla birlikte, proteinlerin saflaştırılması görevini büyük ölçüde kolaylaştıran son gelişmeler kaydedilmiştir. Yeni kromatografi Afinite kromatografisinin getirilmesi (Bölüm 9), proteinlerin saflaştırılmasında büyük bir ilerlemeydi. Farklı proteinler arasındaki fizikokimyasal farklılıklardan basitçe yararlanan diğer yöntemlerin aksine, bu teknik aynı zamanda belirli yapısal ve işlevsel farklılıkları da kullanır. Bu tekniğin tek dezavantajı, yüksek moleküler ağırlıklı bir ligand kullanıldığında sabit fazın nispeten düşük numune kapasitesidir, ancak bu sadece hazırlık ölçeğinde bir problemdir.