Haem (0.8 mM’de) ve metabolik ürünleri, hem ve / veya porfirinin amplifikasyon enzimine bağlanması nedeniyle DNA polimerazlarının bilinen inhibitörleridir. Balgamdaki glikoproteinlerin bileşenleri olan asidik polisakkaritler de inhibe edicidir. İdrar veya CSF’ye kıyasla balgam ve kan gibi örneklerden inhibitörlerin çıkarılması için ek adımlar gerekli olabilir.
Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae ve Trichomas vaginalis gibi cinsel yolla bulaşan hastalıkların tespiti için, tamponla toplanan numuneler kullanılarak kendi kendine uygulanan yeni numune alma tekniklerinin, idrar analizine göre PCR tarafından daha hassas olduğu kanıtlanmıştır.
Amplifikasyon enzimleri, EDTA ve heparin gibi örnek toplamada kullanılan reaktifler tarafından da inhibe edilir. Hedef bol miktarda mevcutsa, numunenin seyreltilmesi, nükleik asidi sıfır kopya örnekleme sıklığının düşük olduğu bir seviyede tutarken inhibitör etkiyi ortadan kaldırabilir.
Bunun aksine, nükleik asidin enzimatik veya kimyasal olarak yok edilmesi, amplifiye edilebilir nükleik asit hedeflerinin etkili sayısını azaltacaktır. Hedef organizma ve hücre duvarının dayanıklılığı, ekstraksiyon prosedürü üzerinde önemli bir etkiye sahip olacaktır, örn. M. tuberculosis’in hücre duvarı parçalanmaya özellikle dirençli iken, Myco-plazma spp. kendiliğinden eriyecek.
Amplifikasyon Tıp
Hedef amplifikasyon nedir
Gen amplifikasyonu
Sinyal amplifikasyon nedir
Elektronik amplifikasyon nedir
Pcr amplifikasyon nedir
Sinyal amplifikasyonu ne demek
Ses amplifikasyon nedir
M. tuberculosis gibi patojenler hedef organizma olduğunda, moleküler teknikler kullanan laboratuvar personelini korumak da önemlidir. Bu nedenle, ekstraksiyon prosedürüne sterilizasyon adımlarının dahil edilmesi gerekli olabilir. Özel ekipman gereksiniminin azalmasıyla minimum örnek işleme ve sağlam protokoller gereklidir.
Bakteriyel DNA’nın geniş aralıklı amplifikasyonu, bir dizi hedef organizmadan DNA’yı serbest bırakan ve inhibe edici faktörleri ortadan kaldıran örnek işlemeyi gerektirir. Parçalanması zor hücre duvarlarına sahip organizmaların gelişmiş tespiti için, ek bir sonikasyon adımı ile cam elyaf filtre kolonları ile DNA saflaştırmanın standart fenol-eter DNA ekstraksiyonu kadar iyi olduğu kanıtlanmıştır.
Örnek hazırlama prosedürleri, klinik örneklerde hedef saptamanın güvenilirliğine katkıda bulunur; Çok sayıda ticari kit mevcuttur ve DNA ekstraksiyon tekniklerinin özellikle örnek türüne göre dikkatlice seçilmesi şiddetle tavsiye edilir.
Ticari kitlerin dışkı örneklerinden DNA ekstraksiyonunda ve Plasmodium falciparum’un moleküler epidemiyolojik çalışmaları için hızlı DNA ekstraksiyonunda üstün olduğu kanıtlanmıştır; yine de ticari olmayan yıkama / alkali / ısı lizizinin, kan kültürü materyalinden bakteri, maya ve mantar DNA’sının ekstraksiyonu için en hassas ve basit yöntem olduğu kanıtlanmıştır.
Bazı çalışanlar, özellikle bağırsak protozoası ile ekstrakte edilmiş DNA’nın geri kazanımını ve saflığını en üst düzeye çıkarmak için ticari kitleri modifiye etti. Numune hazırlama yetersizse, yanlış negatif sonuçlar üretilebilir.
Amplifikasyon
Nükleik asit hedefleri, DNA veya RNA, çift veya tek sarmal olabilir ve izole edildikten sonra bozunmaya karşı stabilize edilmelidir. RNA’nın stabilize edilmesi DNA’dan daha zordur. Kirletici DNA bulunmaması, RNA izolasyonu için bir gerekliliktir. DNA veya RNA’nın seçici ekstraksiyonu veya yok edilmesi, kişinin uygun nükleik asidi hedeflemesine izin verir. rRNA kaotrop solüsyonlarda oda sıcaklığında aylarca stabilize edilebilir.
Yaşam döngülerinde bir RNA ve bir DNA aşamasına sahip olan patojenler sorunludur. Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) genellikle mRNA’yı tespit eder, ancak bu hedefi yok etmek için adımlar atılmadıkça DNA’yı da tespit eder.
Nükleik asit sekansına dayalı amplifikasyon (NSABA), mRNA’yı saptamak için de kullanılabilir; bu, termal döngüleyici gerektirmeyen izotermal bir reaksiyondur. Daha yakın zamanlarda, ters transkriptaz-sarmal yer değiştirme amplifikasyonu (RT-SDA) da bakteriyel canlılığın bir göstergesi olarak kullanılmıştır.
Teorik olarak yalnızca RNA şablonlarını kullanabilen kendi kendini sürdüren sekans replikasyonu (3SR) gibi amplifikasyon yöntemleri, ekstraksiyon tekniğinin bir parçası olarak bir denatürasyon adımı dahil edilmedikçe DNA’yı amplifiye etmemelidir. Tek sarmallı DNA’nın bu RNA’ya özgü yaklaşıma gerçekten müdahale edip etmediğini belirlemek önemlidir.
Analojik olarak, PCR ters bir transkripsiyon adımı PCR’den önce gelmedikçe sadece DNA’yı tespit edecektir. Adli patolojide kan ve semen lekelerinin araştırılması, DNA ve RNA’nın etanol çökeltme asidi fenol / kloroform ekstraksiyonu kullanılarak analiz için aynı örnekten aynı anda izole edilebileceğini göstermiştir.
Stabil nükleik asitleri hedefleyen amplifikasyon yöntemleri, ölü, hareketsiz ve replike olan organizmaları tespit edebilir. Organizmanın tüm formlarının tespiti, taşıma veya saklama sırasında canlılık hızla kaybolduğunda veya organizma kültürlenemediğinde avantajlı olabilir. Bununla birlikte, ölülerin canlı organizmalardan ayrılması, eğer canlı olmayan veya hareketsiz organizmalar aktif enfeksiyon ortadan kalktıktan sonra kalırsa bir sorun teşkil edecektir.
Kalite Kontrol
İzole edildikten sonra hedef, amplifikasyonla uyumlu sulu bir ortama yerleştirilmelidir. Amplifikasyon enzimleri, nükleik asitlerin saflaştırılması için moleküler biyolojide kullanılan birçok reaktif tarafından inhibe edilir; bunlar sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi deterjanları veya özellikle kan ürünlerinden bakteri ve maya DNA’sının ekstraksiyonunda hücre zarlarını çözündürmek veya nükleazları inaktive etmek için kullanılan guanidinyum HCl gibi kaotropları içerir.
Bu tür reaktifleri çıkarmak veya nötralize etmek için ek adımlar atılmalıdır. Klinik moleküler biyoloji tekniklerinde reaktiflerin ve ekipmanın kalite kontrolü son derece önemlidir. PCR kadar güçlü ve hassas tekniklerle, kontaminasyon nedeniyle yanlış pozitif reaksiyon riski ve reaksiyon inhibitörleri nedeniyle yanlış negatifler riski, tekniği nispeten pahalı hale getiren titiz kaçınma prosedürlerine yol açmıştır ve bu da tekniği göreceli olarak pahalı hale getirmiştir.
Tanısal mikrobiyolojide özellikle önemli olan, yanlış negatiflerden kaçınmak için ek kontrollerin kullanılmasıdır, yani bir kontrol sekansının düşük kopya sayısının intrinsik DNA kontrolleri klinik numuneye eklenebilir. Kontrol amplifiye olmazsa, örneğin inhibitör olduğu varsayılabilir.
Özel ekipman gereksinimleri, tıkalı uçları veya pozitif yer değiştirmeli pipetleri, ayrı iş istasyonlarını, termocycler’ları ve algılamaya dayalı ekipmanı içerir. Hepsi büyük bir ilk mali harcama gerektirir. Doğrulama eksikliği ve standart protokollerin yanı sıra değişken kalitedeki reaktifler ve ekipman nedeniyle, moleküler teknikler hala referans laboratuarlarının ve araştırma birimlerinin aracıdır.
Avrupa Komisyonu, gıdalardaki patojenik bakterilerin tespiti için tanısal PCR kullanımının geçerliliği ve standardizasyonu ile ilgili araştırmaları onaylamıştır ve gelecekte klinik tanıdaki benzer gelişmelerin nihayetinde daha genel kullanıma yol açabileceği umulmaktadır.