Mikrobiyoloji laboratuvarında yapılan çalışmalar

Leica AS LMD Leica AS LMD, PCR, RT-PCR ve proteomik için hazırlık olarak hücrelerin veya hücre gruplarının hassas lazer mikrodiseksiyonunu sunan başka bir sistemdir. Bu sistem “üçüncü nesil” bir mikrodiseksiyon platformudur. Otomatik dik mikroskop mimarisi, diseksiyon yapan lazer ışınının ve diseke edilen alanın üç boyutlu optik kontrolü, temassız doku örneklemesi ve motorlu diseksiyon sonrası kullanımı birleştiren geliştirilmiştir. LCM, enstrümantasyon ve temel fonksiyonun bilgisayar kontrolünde ilerlemeler ile bir teknik olarak gelişmeye ve genişlemeye devam ediyor. Daha kesin tek hücreli teknikler ortaya çıkıyor ve aşağı akış uygulamalarının tedarikçileri tarafından protokoller veya ekstraksiyon kitleri ile birleştiriliyor. Nispeten kısa bir zaman diliminde, LCM biyolojik materyalden saf hücre popülasyonları elde etmek için paha biçilmez bir araç olarak kendini sağlamlaştırdı ve fonksiyonel genomik, proteomik ve genomik alanlarında doku bazlı protokollerin paha biçilmez bir bileşenidir. Gerçek Zamanlı PCR Gen Analizi Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu analizi (PCR), polimeraz zincir reaksiyonunun her döngüsü sırasında üretilen ürünlerin güvenilir bir şekilde saptanmasını ve ölçülmesini içeren orijinal PCR tekniğinin bir modifikasyonudur. Teknik, PCR ürününün hedef dizisi içinde hibritleşmek üzere tasarlanmış floresan etiketli bir probun kullanımına dayalı olarak spesifik PCR ürünlerinin saptanmasına dayanır. PCR döngüsü sırasında, artan floresan sinyalinin tespiti, amplifikasyon ürünlerinin birikmesiyle orantılıdır. Bu nedenle, belirli bir numunedeki floresan ölçümü, spesifik olarak amplifiye edilen hedefle bağlantılı ve kantitatif olarak PCR ürününün miktarıyla ilgili bir sinyal sağlar. Gerçek zamanlı PCR, 50 nükleaz tahlili, saç tokası primerleri, akrep probları, ara boyalar, örn. SYBR green ve FRET (serbest rezonans enerji transfer teknolojisi) ve çift problu hibridizasyon sistemleri (moleküler işaretler) kullanılıyor. Bu bölümde, TaqMan1 PCR olarak bilinen 50 nükleaz tahlilini ve patoloji laboratuvarlarında kullanım için uygulamalarını tartışacağız. Qrt-PCR Nedir TaqMan prob yöntemi Real time PCR İnternal kontrol Nedir Real-Time PCR Cihazı çalışma prensibi Real-time PCR Makale real-time pcr grafik yorumlama Real-time PCR sonuç değerlendirme Gerçek zamanlı PCR kimyaları DNA bağlayıcı boyalar----SyBR yeşili Spesifik olmayan dizi saptama yöntemlerinin temeli, SYBR yeşili veya etidyum bromür gibi ara boyaların kullanılmasıdır. Bağlanmamış boya, çözelti içinde çok az floresan sergiler, ancak PCR'nin uzatma aşaması sırasında, artan miktarlarda araya giren boya, yeni oluşan çift sarmallı DNA'ya bağlanır. SYBR green'in bir PCR reaksiyonuna dahil edilmesi, floresan emisyonundaki artışı gerçek zamanlı olarak izleyerek ürün birikiminin tespit edilmesini sağlar. Bu, hedefe özel floresan problara olan ihtiyacı ortadan kaldırarak daha fazla esneklik sağlar; bununla birlikte, kullanılan primerlerin reaksiyonun genel özgüllüğünü belirlediğine dikkat etmek önemlidir. Ek olarak, herhangi bir çift sarmallı DNA'nın mevcudiyeti floresan üretebildiğinden, tahlil özgüllüğü geleneksel PCR'ye benzerdir ve boyanın spesifik olmayan amplifikasyona ve primer dimerlerine bağlanmasıyla ilgili problemlerle karşılaşılabilir. Spesifik olmayan amplifikasyonu tespit etmek için bir disosiasyon eğrisi oluşturularak spesifiklik geliştirilebilir. Ayrışma eğrisi analizi, tamamlanmış bir PCR'den sonra gerçekleştirilir. Bu, sürekli olarak floresan verileri toplanırken PCR reaksiyonunun sıcaklığının 65°C'den 95°C'ye (amplikonun erime sıcaklığının üzerinde) yavaş yavaş yükseltilmesiyle elde edilir. Sıcaklık arttıkça, PCR ürünü denatüre olur ve amplikonun erime sıcaklığında karakteristik bir erime zirvesi yaratır; bu, daha düşük sıcaklıklarda eriyen amplifikasyon artefaktlarından ayırt edilebilir. Moleküler işaretçiler ve hibridizasyon probları Bu sistemde iki hibridizasyon probu kullanılır. Bir sonda, 30. ucunda bir flüoresan donör molekülü taşır; bu molekül, emisyon spektrumu, ikinci bir sondanın 50 ucundaki bir alıcı sonda ile örtüşür. Çözeltide, iki boya ayrıdır. Bununla birlikte, denatürasyon adımından sonra, tavlama sırasında hedef dizi ile hibritleşirler ve baştan sona bir konfigürasyon benimserler. Bu, iki floresan molekülünü yakın bir konuma getirir ve floresan parçası enerjisini ikinciye aktarabilir. İkinci molekül tarafından yayılan ışık enerjisi daha sonra izlenebilir ve artan flüoresans seviyeleri, PCR reaksiyonu sırasında sentezlenen DNA miktarına karşılık gelir. Bu sistemin ek bir avantajı, probların hidrolize olmaması ve erime eğrilerinin oluşturulmasına olanak tanımasıdır. Bunlar, amplifikasyon verimliliğini izlemek için kullanılabilir. Hidroliz Probları TaqMan1 testi, hedef amplikona bağlı bir hibridizasyon probunu hidrolize etmek için Taq veya rTth DNA polimerazın 50-30 eksonükleaz aktivitesini kullanır. Bu sistemde, hedefe bağlanmak için üç oligonükleotit gereklidir. İki şablona özgü primer, amplikonun uç noktalarını tanımlar ve bir birinci özgünlük seviyesi olarak hizmet eder. Primerler tarafından tanımlanan noktalara dahili olarak bağlanan spesifik bir probun dahil edilmesiyle daha ileri bir spesifiklik seviyesi elde edilir. TaqMan1 probunun özellikleri, 50 uçta emisyonu 30 uçta ikinci bir molekül tarafından söndürülen bir floresan raportör molekülü içerir. Muhabirin sağlam bir sondada söndürücüye uzamsal yakınlığı, net floresansın saptanmamasını sağlar. Floresan salınımı, yalnızca hedefe özel amplifikasyon meydana gelirse gerçekleşir ve amplifikasyonun ardından amplikonu doğrulama ihtiyacını ortadan kaldırır. TaqMan PCR kimyası --- 50 nükleaz tahlili TaqMan teknolojisi, ilk olarak Holland ve diğerleri tarafından açıklanan 50 nükleaz testine dayanan nicel bir gerçek zamanlı PCR tekniğidir. (1991). Teknik, hedef dizi içinde hibritleşmek ve PCR'nin tavlama/uzatma aşamasında, PCR'nin başlangıcından önceki şablon miktarıyla orantılı olarak PCR döngüsü sırasında biriken bir sinyal oluşturmak için tasarlanmış floresan probları kullanır. Bu sistemin temeli, TaqMan probu adı verilen çift etiketli spesifik bir florojenik oligonükleotit probu kullanarak PCR ürünlerini birikirken sürekli olarak ölçmektir. TaqMan probu, iki farklı boya, 30 söndürücü boya ve 50 raportör boya ile etiketlenmiş kısa (20-25 $ baz) bir oligonükleotit ve PCR sırasında prob uzamasını önlemek için 30 bloke edici fosfattan oluşur. Floresan haberci boya, ör. FAM (6-karboksi-florosein), VIC1 veya JOE (2,7-dimetil-4,5,-dikloro-6-karboksifloresein), oligonükleotit probunun 50 ucuna kovalent olarak bağlıdır. TET (tetrakloro-6-karboksi-florosein) ve HEX (heksakloro-6-karboksi-florosein) de bu sistemde floresan haberci boyalar olarak kullanılabilir. Bu habercilerin her biri, bir LAN (bağlayıcı-kolla modifiye edilmiş nükleotit) tarafından 30 ucuna bağlanan floresan olmayan bir söndürücü olan TAMRA (6-karboksi-tetrametil-rodamin) (söndürücü boya) ile söndürülür. sonda. Prob, PCR uygulamaları sırasında probun uzamasını önleyen 30 ucunda kimyasal olarak fosforile edilmiştir. Oligonükleotid prob dizisi, PCR ürününde bulunan bir dahili bölgeye homologdur. Prob sağlam (doğrusallaştırılmış) olduğunda, iki flüorofor arasında Fo rster tipinde enerji transferi meydana gelir ve raportör flüoresansının bastırılmasıyla sonuçlanır.