KAPILLER ELEKTROFOREZ VE BİYOANALİZ
Karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları tedavi etmek için kullanılan monoklonal antikorlar (rMAb’ler) gibi rekombinant terapötik proteinlerin gelişimi, biyofarmasötik endüstrisinde önemli ölçüde artmıştır. Terapötik proteinlerin üretimi ve raf ömrü sırasında, deamidasyon, oksidasyon, izoaspartat izomerizasyon ve proteolitik bölünmeler gibi çeşitli post-translasyonel modifikasyonlar meydana gelebilir.1–4 Daha iyi bir anlayış kazanmak için bu ürünle ilgili maddeleri karakterize etmek ve izlemek önemlidir. biyofarmasötik bir ürünün biyoaktivitesi ve güvenliği üzerinde ortaya çıkan değişiklikler vardır.
Ayrıntılı ürün karakterizasyonu, üretim süreci kontrollerinin uygunluğunu destekler ve süreç değişikliklerinin ilacın kimliği, gücü, kalitesi ve saflığı üzerindeki etkisinin ölçülmesine yardımcı olur, çünkü bu faktörler ilacın güvenliği ve etkililiği ile ilgilidir.5,6 Analitik bu nedenle bu terapötik proteinlerin yük, boyut ve hidrofobiklik gibi fizikokimyasal özelliklerini değerlendirmek için teknikler gereklidir.
Giderek kabul gören tekniklerden biri de kapiler elektroforezdir (CE). Adından da anlaşılacağı gibi CE, bir elektrolit ile doldurulmuş küçük bir delikli kapiler lümen içindeki analitleri ayırır. Ayırma mekanizması, bir elektrik alanına maruz kaldığında analitlerin farklı göçüne dayanır. 1960’ların sonundaki ilk başlangıcından bu yana, çoğu geleneksel elektroforetik metodolojilere benzer CE teknikleri kanıtlanmıştır: bölge elektroforezi, izoelektrik odaklama (IEF), izotakoforez ve moleküler eleme ayırmaları.
CE, modern enstrümantasyon tasarımının bir sonucu olarak, boyama ve boyama ihtiyacını ortadan kaldıran absorbans veya floresan gibi çevrimiçi konsantrasyona duyarlı dedektörler ve otomasyon yetenekleri dahil olmak üzere, geleneksel elektroforetik tekniklere göre birçok avantaj sunar. Veri sunumu ve analizi, yüksek performanslı sıvı kromatografisine (HPLC) benzer; çıktı (tepe noktaları veya taban çizgisi) bir elektroferogram olarak görüntülenebilir ve tepe alanı veya yükseklik şeklinde nicel bilgi elde etmek için entegre edilebilir.
Geleneksel elektroforez ile karşılaştırıldığında, mükemmel ısı yayma özelliklerine sahip dar delikli kapilerler çok yüksek elektrik alanlarının kullanılmasını sağladığından, CE, yüksek çözme gücü ve azaltılmış analiz süresi ile karakterize edilir. Birçok avantajı nedeniyle CE, biyoteknoloji ürünlerinin karakterizasyonunda analitik bir araç olarak büyük umut vaat etmektedir ve genellikle farklı ayırma seçiciliği, iyileştirilmiş miktar belirleme ve otomatikleştirilmiş analiz sağlayan mevcut tekniklerle birlikte kullanılır.
Sodyum dodesil sülfat ne ise yarar
Sodyum dodesil sülfat Nedir
Sodyum Dodesil sülfat ne ise yarar
Sodyum dodesil sülfat Poliakrilamid jel elektroforezi
Sodyum dodesil sülfat deterjan
Sodium dodecyl sulfate
Sodyum Dodesil Benzen sülfonat
Sodyum Dodesil Sülfat fiyat
Bu bölüm, üç ana alana odaklanarak rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak üretilen terapötik proteinlerin analizi için CE uygulamalarına genel bir bakış sağlar:
- (i) Geleneksel sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezinin (SDS- yerine) CE-SDS PAGE) ve IEF metodolojileri,
- (ii) proteinlerin yük heterojenliğini belirlemek için iyon değişimli sıvı kromatografisine ortogonal ayırma tekniği olarak kapiler bölge elektroforezi (CZE) ve
- (iii) rMAb’lerden N-bağlı oligosakaritlerin salımının analizi için CE.
Bu bölümün son bölümünde, yukarıda bahsedilen CE yöntemlerinin bir kalite kontrol laboratuvarında uygulanmasına genel bir bakış sunulmaktadır.
KAPİLLER ELEKTROFOREZ
SODYUM DODESİL SÜLFAT (CE-SDS)
SDS-PAGE geleneksel olarak boyuta dayalı protein ayrımları için birincil yöntem olarak kullanılmıştır.7 SDS, benzer yük yoğunlukları ve proteinlerin sabit kütle-yük oranları elde edilecek şekilde polipeptit zincirlerine bağlanır. Ardından, boyuta bağlı olarak SDS – protein komplekslerinin elektroforetik ayrımı bir eleme ortamında elde edilir. Ayrılan proteinlerin SDS-PAGE ile tespiti genellikle Coomassie Brilliant Blue, 9 veya daha hassas gümüş leke boyaları ile boyanarak gerçekleştirilir.
Bir proteinin moleküler kütlesinin logaritması elektroforetik hareketlilik ile doğrusal olduğundan, belirli bir proteinin moleküler ağırlığı bir dizi protein standardından tahmin edilebilir. SDS-PAGE, proteinlerin görünür moleküler ağırlığını belirlemek için bir araç olarak hareket etmenin yanı sıra, biyolojiklerin boyut heterojenliğini, saflığını ve üretim tutarlılığını değerlendirmek için de kullanılır.
Geleneksel SDS-PAGE’in başlıca dezavantajları, analit saptamada kullanılan boyama / boyanma adımları ile ilişkili rahatsızlık ve tekrarlanamazlığı, toksik reaktiflerin kullanımı ve jel içi ve jel arası etkili hareketlilik değişkenliğidir.
Bu engellerin üstesinden gelme çabası içinde, CE ortaya çıkmış ve kolon üzerinde doğrudan UV veya floresan algılama, otomasyon, gelişmiş çözünürlük ve tekrarlanabilirlik ile proteinlerin doğru kantifikasyonu ve moleküler ağırlıklarının belirlenmesi dahil olmak üzere klasik SDS-PAGE’ye göre birçok avantaj göstermiştir. . Halen, doğrusal poliakrilamid, polietilen oksit, polietilen glikol, dekstran ve pullulan gibi doğrusal veya hafif dallı polimerler, kapiler elektroforez sodyum dodesil sülfat (CE-SDS) için eleme matrisi olarak sıklıkla kullanılmaktadır.
Çapraz bağlı poliakrilamid jel matrisine kıyasla, bu polimerler, suda çözünebilir ve her CE analizinden sonra değiştirilebilir olduklarından CE-SDS’ye büyük esneklik katarlar, bu da genel hassasiyet ve sağlamlığın artmasıyla sonuçlanır. Bununla birlikte, UV tespiti ile zayıf kütle hassasiyeti ve birden fazla numuneyi aynı anda ayıramama gibi dezavantajlar vardır. Bununla birlikte, CE-SDS’nin yüksek hızlı ayırma, verimlilik ve kullanım kolaylığı bu sınırlamalardan ağır basmaktadır.
Birkaç grup, antikorların hem kalitatif hem de kantitatif analizi için UV tespiti ile CE-SDS’nin kullanıldığını bildirmiştir. Bennett ve arkadaşları 30 bu tekniği sığır immünoglobulin G’yi (IgG) analiz etmek ve ölçmek için kullandı. CE-SDS ile belirlenen moleküler ağırlıklar, Coomassie Blue boyama ve yayınlanmış değerlere sahip SDS-PAGE ile ölçülenlerle karşılaştırılabilirdi.
Protein miktar tayininin yeniden üretilebilirliği, yaklaşık% 13’lük bir bağıl standart sapma (RSD) ile sonuçlandı. Başka bir çalışma, anti-kanser ilacı doksorubisin ile kimerik (fare-insan) monoklonal antikor konjugatlarının fragmanlarını tespit etmek için CE-SDS’nin kullanıldığını gösterdi. Hunt ve ark. Çalışmalarında antikorların agregalarını ve fragmanlarını tespit etti.
Geçiş süresinin analiz içi ve arası kesinliği yaklaşık% 2 idi ve daha küçük pikler için normalize edilmiş tepe alanlarının kesinlik değerleri% 3 ile 8 arasındaydı. Lee, yüksek iyonik güç ve / veya yüksek pH koşullarının yanı sıra numunelerin ısıl işleminin de SDS-rMAb komplekslerinin parçalanmasını artırdığını gözlemledi.
Hunt ve Nashabeh, düşük seviyeli safsızlıkların tespiti için gümüş lekeli SDS-PAGE yerine rMAb’lerin ön kolon etiketlemesi ve lazerle indüklenen floresan (LIF) tespiti ile bir CE-SDS yöntemi geliştirdi. Eser seviyesinde rMAb varyantlarının analizi ve 50 ppm kadar düşük seviyelerde proses safsızlıkları rapor edildi.