Fonksiyonel Çalışmalar
T lenfositler
Bir bağışıklık tepkisi sırasında normal T hücreleri, in vitro olarak değerlendirilebilen çeşitli işlevler sergiler. Bunlar proliferasyon, hücre yüzeyi antijenlerinin upregülasyonu, sitokin üretimi ve apoptozu içerir.
Çoğalma
T lenfosit proliferasyonunun ölçümü, bağışıklık yeterliliklerini değerlendirmek için iyi kurulmuş bir yöntemdir. Daha önce, mikroskopta hücrelerin görünümündeki değişiklikler, çeşitli uyaranlara aktivasyon ve çoğalma tepkisini değerlendirmek için kullanılıyordu – bu nedenle bu teste sıklıkla uygulanan “lenfosit transformasyonu” terimidir.
Birkaç on yıl boyunca bu süreç, çoğalan hücrelerin DNA’sına radyo-etiketli 3H timidin katılımının ölçülmesiyle daha doğru bir şekilde ölçülmüştür. 2-7 günlük bir kültürün son 16 saatinde hücre kültürüne trityumlu timidin eklenir ve hücreler daha sonra bir kağıt filtreye toplanır.
Sintilasyon sayımı ile saptanan dahil edilen radyoaktivite miktarı, çoğalan hücrelerde meydana gelen DNA replikasyonu ile orantılıdır. Hem mutlak dahil edilen radyoaktivite (arka plan sayımları için düzeltme yapıldıktan sonra parçalanmalar veya dakika başına sayımlar olarak) hem de stimülasyon indeksi (uyarılmış hücrelerden alınan sayıların stimüle edilmemiş hücrelerden gelen sayılara bölünmesi) rapor edilmelidir.
Lenfosit proliferasyonunu ölçmek için alternatif yöntemler de geliştirilmiştir, ancak bunların hiçbiri şimdiye kadar klinik laboratuvarlarda standart teknik olarak timidin katılımının yerini almamıştır.
Bunlar, aktivasyon antijen ekspresyonunun (örn. CD25, CD69, Ki67), bromodeoksiüridin dahil edilmesinin veya hücre içi boya karboksi-floresan diasetat süksinimidil esterin (CFSE) aktive ve çoğalan T hücreleri tarafından seyreltilmesinin akış sitometrik olarak saptanmasını içerir. Bu yöntemler, radyoizotopların kullanımını ve ölçülmesini gerektirmeme avantajına sahiptir.
Sitokin nedir
Sitokinin nedir
Sitokin içeren ilaçlar
Sitokin fırtınası
Kemokin nedir
Kemokinler nelerdir
Antiinflamatuar sitokinler
Sitokin yüksekliği nedir
T hücreleri, bir dizi uyarana yanıt olarak çoğalmak üzere uyarılabilir ve bunlar genellikle bir doz-yanıt göstermek için çeşitli konsantrasyonlarda kullanılır. İyonomisin ve bir kalsiyum iyonofor tarafından kalsiyum akışının uyarılması birçok hücre tipini uyaracaktır ve bu aktivasyon normal hücre sinyal yollarından tamamen bağımsızdır.
İlk olarak kırmızı kan hücrelerini aglütine etme yeteneği ile tanımlanan bir bitki lektini olan fitohemagglutinin ve konkavalin A, bir dizi yüzey reseptörü aracılığıyla tüm T hücrelerini uyaracaktır. Kalıtsal şiddetli kombine immün yetmezliği (SCID) olan bebekler bu mitojenlere yanıt olarak çoğalamazlar. Poke-weed mitojen hem T hem de B hücrelerini uyarır. Daha ‘fizyolojik’ bir yaklaşım, T hücresi reseptörü yoluyla T hücresi stimülasyonunun normal yolunu taklit etmektir.
Bu, reseptörün anti-CD3 antikorlarıyla (tüm T hücrelerini aktive edecek) çapraz bağlanmasıyla veya kültüre antijen eklenmesiyle elde edilebilir. Antijenler kan monositleri tarafından alınır ve T hücre uyarıcı peptitler MHC sınıf II molekülleri bağlamında T hücrelerine sunulur.
Bu tür antijene özgü çoğalma, toplam periferik kan T hücrelerinin yalnızca küçük bir bölümünü aktive edecektir (104’te 1 kadar) ve buna göre saptanan çoğalma miktarı, mitojen uyarımı ile görülenden daha az olacaktır.
Nadiren, hastalar büyük ölçüde normal T hücre fonksiyonuna sahip ancak daha ayrıntılı testlerde ince kusurlar ile tespit edilir, örn. kronik mukokutanöz kandidiyazda hastanın T hücreleri, Candida hariç tüm mitojenik ve antijenik uyaranlara iyi yanıt verir. Bağışıklık repertuarındaki bu dikkate değer “delik” açıklanamıyor.
NOT: (a) PHA 250 mg/ml (j), PWM 100 mg/ml (d) ve OKT3 1 mg/ml (r) mitojenlerine yanıt olarak lenfosit proliferasyonu. 3H Timidin katılımı, parçalanma/dakika olarak belirtilmiştir. Huissoon ve ark. (2002), Blackwell Publishing Ltd.’nin izniyle. (b) Hücre çoğalmasını ölçmek için CFSE seyreltme ilkesini temsil eden histogram. Hücreler, prosedürün başlangıcında CFSE ile yüklenir.
Bu, hücresel fonksiyona müdahale etmeyen sitoplazmik bir boyadır. Hücreler birkaç gün boyunca mitojen veya antijen ile inkübe edilir ve CFSE yoğunluğu akış sitometrisi ile analiz edilir. Yukarıdaki temsilde, sağdaki tepe noktası, hücre bölünmesine uğramamış hücreleri temsil eder ve bu nedenle CFSE’nin tam başlangıç miktarını içerir.
Her bir hücre bölünmesi ile boya yoğunluğu yarıya iner, böylece her bir bölünme turu, çoğalmayan hücrelerin solunda yeni bir tepe noktası olarak tanımlanabilir. Hücreleri soy spesifik antikorlarla birlikte etiketlemek, hangi hücre tiplerinin uyarana yanıt verdiğini ve hangilerinin yanıt vermediğini belirleyebilir.
Sitokin Üretimi
Mitojenik ve antijenik uyaranlara yanıt olarak sitokin üretimi de ölçülebilir. Sitokin üretimi T hücrelerinin önemli bir işlevi olduğundan, belirli uyaranlara karşı kusurlu sitokin üretiminin saptanması klinik öneme sahip olabilir. Kusurlu sitokin üretiminin neden olduğu hastalıklar artık tarif edilmeye başlandı (örneğin, IL-12 eksikliği).
T hücresi sitokin üretimi, ya kültür süpernatantında ELISA ile, Elispot tekniği ile ya da floresan antikor boyama ile tek tek T hücrelerinde hücre içi sitokinlerin doğrudan saptanmasıyla ölçülebilir. Elispot testinde, uyarılmış T hücreleri, spesifik bir sitokine (örn. interferon-) karşı antikorlarla kaplanmış düz tabanlı plastik kültür kuyularına yerleştirilir.
T hücreleri tarafından salgılanan herhangi bir sitokin, kuyudaki antikor tarafından bağlanır. Bir inkübasyon periyodundan sonra hücreler yıkanır ve bağlı sitokin, o sitokine karşı ikinci bir antikor tarafından tespit edilir. Bu, bir kromojenik enzim-substrat reaksiyonu ile görselleştirilir ve kuyudaki her nokta, sitokin salgılayan bir T hücresini temsil eder.
Akış sitometrisi ile sitokinlerin hücre içi tespiti, Elispot yönteminden daha az hassastır, ancak yüzey belirteçleri kullanılarak tek tek sitokin üreten hücrelerin daha fazla karakterizasyonuna izin verir. T hücreleri antijen veya mitojen tarafından uyarılır ve inkübasyonun sonuna doğru endoplazmik retikulumdan sitokin taşınmasını engellemek için brefeldin A veya monensin eklenir.
Bu, doğrudan antikor etiketlemesi ile tespit edilecek yeterli hücre içi sitokinin birikmesiyle sonuçlanır. Hücreler daha sonra uygun yüzey antijenlerine karşı floresan antikorlarla etiketlenir, örn. CD3 ve CD69 ve hücre zarı sabit ve geçirgendir. Bu, hücre içi sitokinin spesifik antikorla etiketlenmesini sağlar.
NOT: Stafilokokal enterotoksin B ile uyarılan T hücrelerinde interferon-gama (IFN- ) ifadesi. CD69 (dikey eksende) aktif T hücrelerini tanımlar ve bunların yaklaşık %10’unun IFN- ifade ettiği görülür. Huissoon ve ark. (2002), Blackwell Publishing Ltd’nin izniyle yapılır.