Teknikler arasındaki ayrım genellikle bulanıktır çünkü “hedef” amplifikasyon prosedürleri genellikle “sinyal” ve / veya “prob” amplifikasyon unsurunu içerir.
Ticari olarak temin edilebilen bir dizi tahlil artık bu formatlar altında, farklı prensiplere dayalı olarak ve farklı prosedür adımlarıyla kullanım için mevcuttur.
Bununla birlikte, ticari ürünler yalnızca sınırlı bir viral patojen aralığı için mevcuttur ve sonuç olarak, çoğu klinik laboratuvar, ticari olarak temin edilebilen testlerin ve kendi ‘kurum içi’ (yani, ‘evde üretilmiş’, kendi kendine üretilen) bir kombinasyonunu kullanacaktır. ) test prosedürleri, sonuncusu neredeyse sadece polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanmaktadır.
Hedef Büyütme
Polimeraz Zincirleme Reaksiyonu
Çok yönlülüğü ve kullanım kolaylığı nedeniyle ilk geliştirilen NAAT olan PCR, aynı zamanda en yaygın kullanılan tekniktir. PCR, her biri çift sarmallı bir DNA (dsDNA) hedefinin bir sarmalına hibridize olan iki sentetik oligo-nükleotid molekülünün kullanımını içerir.
Bu oligonükleotid molekülleri, amplifiye edilecek virüs nükleik asidinin nükleik asidi içindeki spesifik bir hedef bölgeye bağlanmak üzere dikkatlice tasarlanır. Bu nükleik asit içinde belirli bir bölgeye yayılırlar. Oligonükleotidin DNA’ya hibridizasyonu, bir DNA polimeraz enzimi için bir primer görevi görür (en yaygın olarak, başlangıçta termofilik bakteriden türetilen ve Taq polimeraz olarak bilinen, ısıya dayanıklı bir enzim olan Thermus aquaticus).
Enzim, deoksinükleotidleri sırayla ekleyerek tamamlayıcı bir DNA zinciri oluşturur. Bu işlemi başlatmak için hedef dsDNA, 90 C’yi aşan bir sıcaklığa ısıtılır. Bu sıcaklıkta DNA şeritleri ayrışır.
Reaksiyon karışımı daha sonra 50-70 ° C’lik bir sıcaklığa soğutulur ve sentetik oligonükleotid primer molekülleri tekli DNA ipliklerinin her birine bağlanır. Ardından sıcaklık, Taq polimerazın tamamlayıcı DNA zincirinin uzamasını etkilemesi için en uygun sıcaklık olan 72–76 ° C’ye hafifçe yükseltilir.
Sıcaklık döngüsünü 30 veya daha fazla tekrarlayan döngü boyunca tekrarlayarak, orijinal hedef dizinin milyonlarca kopyası üretilir. Sıcaklık değişim hızı ve sürenin uzunluğu programlanabilir bir termal döngüleyici tarafından kontrol edilir.
Amplifikasyonun tamamlanmasının ardından reaksiyon karışımı, spesifik amplifikasyonun meydana gelip gelmediğini belirlemek için analiz edilir. Geleneksel yöntem, reaksiyon karışımını etidyum bromid varlığında agaroz veya poliakrilamid jeller içinde elektroforeze etmektir.
Etidyum bromür, dsDNA ile interkalasyon yapar ve ultraviyole ışığa maruz kaldığında, nükleik asidi açığa çıkarmak için flüoresans yapar. Southern blotlama, test reaksiyon ürününün özgüllüğünü doğrulamak için kullanılabilir.
Southern blotting işleminde, nükleik asit reaksiyon ürününün ara-primer bölgesine bağlanmak üzere tasarlanmış etiketlenmiş bir oligonükleotidin elektroforetik olarak ayrılmış ürün ile hibridize olmasına izin verilir ve bağlanması, otoradyografi kullanılarak tespit ile ortaya çıkarılır.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu nedir
Polimeraz Zincir Reaksiyonu aşamaları
Polimeraz zincir reaksiyonu testi
Dna polimeraz Nedir
Polimeraz Zincir reaksiyonu için kullanılan materyaller
PCR tarihçesi
Polimeraz Zincir Reaksiyonu hangi yılda
Pcr yöntemi nedir
Daha az zahmetli bir hibridasyon saptama yöntemi, büyütülmüş DNA’yı denatüre etmek ve tek sarmallı DNA’yı, oligonükleotid primerlerinden birine dahil edilmiş avidin veya biyotin kullanılarak bir katı faz (genellikle bir polistiren mikrotitre plaka) üzerinde yakalamaktır.
Etiketli bir oligonükleotidin yakalanan amplikon DNA’ya bağlanmasına izin verilir ve bunun bağlanması, bir kromojenik substratın enzim katalizli dönüşümünü içeren bir reaksiyonda ortaya çıkar. RNA virüslerini tespit etmek için, RNA şablonunun bir DNA kopyasını (cDNA) üretmek için bir başlangıç reaksiyonu gereklidir.
Bu, ayrı bir ters transkriptaz enziminin veya termostabil ters transkripsiyon ve DNA polimeraz aktivitesine sahip enzimlerin eklenmesiyle gerçekleştirilen ters transkripsiyon kullanımıyla gerçekleştirilir.
İki ayrı reaksiyonda dört primer oligonükleotidin kullanımını içeren yuvalanmış PCR dahil olmak üzere, temel PCR prosedürünün çok çeşitli modifikasyonları mümkündür. Birinci tur PCR amplifikasyonunun ürünleri, termal amplifikasyonun birinci turunda kullanılan setin içindeki ikinci bir primer oligonükleotid seti kullanılarak ikinci bir termal amplifikasyon turunda yeniden amplifiye edilir.
Metodoloji seçimi, PCR’nin gerçekleştirildiği pratik koşullar ile birlikte istenen hassasiyet ve özgüllük gereklilikleri tarafından belirlenir.
Tüm PCR prosedürleri için özel tesisler ve ekipmanla birlikte yüksek derecede teknik beceri gereklidir, ancak yuvalanmış PCR, amplifiye DNA’nın taşınmasını önlemek için birinci ve ikinci tur prosedürleri fiziksel olarak ayırma ihtiyacı nedeniyle ek özel tesisler gerektirir. (‘amplikonlar’) birinci tur amplifikasyondan ikinci tura, yanlış pozitif test sonuçlarına yol açar.
Klinik viroloji laboratuvarı ortamında PCR’nin faydasını geliştirmek için, çoklu viral nükleik asit hedeflerini tespit edebilen PCR’ler geliştirilmiştir. Bu “multipleks” PCR teknikleri tipik olarak tek bir reaksiyon içinde birkaç primer oligonükleotit çiftini içerir. Birkaç hedef nükleik asitten herhangi birinin amplifikasyonu, aynı termal döngü koşulları ve reaksiyon karışımı bileşimi kullanılarak mümkündür.
Mevcut kullanımdaki PCR yöntemlerinin büyük çoğunluğu yalnızca nitel (evet / hayır) yanıtlar sağlar. “Viral kantitasyon” veya “viral yük izleme” olarak adlandırılan bir numunede bulunan virüs miktarının belirlenmesi, antiviral kemoterapinin etkisinin değerlendirilmesinde ve hastalığa doğru ilerlemenin izlenmesinde giderek daha önemli hale gelmektedir.
Örneğin, sitomegalovirüs (CMV) DNA’sı için kemik iliği transplantı alıcılarının kanının izlenmesi, CMV hastalığının gelişmesini önlemek için anti-viral ilaç gansiklovir ile pre-emptif tedaviye izin verir.
Antiviral tedavi genellikle kandaki CMV DNA seviyelerinde önemli bir artış tespit edildiğinde başlatılır. Bir numunenin, bilinen miktarlarda viral nükleik asit içeren bir standarda paralel olarak seri seyreltilmesi, ham miktar tayini sağlayabilir, ancak iki numunenin farklı amplifikasyonundan kaynaklanan hataya açıktır ve bu, kantitasyonun testler arası karşılaştırmalarını zorlaştırır.
Daha doğru kantitasyon, bilinen konsantrasyona sahip bir dahili kontrol nükleik asidinin, bilinmeyen konsantrasyondaki numune nükleik asidi ile birlikte kompetitif birlikte amplifikasyonu ile elde edilir; dahili kontrol molekülü, numune hedefine eşit verimlilikle amplifiye etmek için tasarlanmıştır.
Yöntem, hepatit B ve C virüsleri, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve sitomegalovirüs için oldukça başarılı ticari deneylerin temelini oluşturmuştur. İkinci sistemde, testin yüksek derecede otomasyonu ve ürünün tespiti, testler arası değişkenliği daha da azaltır.