Otomatik Sıralama – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Erken dizileme kimyaları, DNA polimeraz I’in Klenow fragmanı gibi polimerazları kullandı veya bakteriyofajdan türetilen T7 DNA polimerazı veya varyantlarını kullandı. Daha yakın zamanlarda, AmpliTaq DNA polimeraz ve varyantları gibi termostabil polimerazlar, zincir sonlandırma ve PCR işleminin birleşmesi ile zincir sonlandırma kimyasını yürütmek için kullanılmıştır.
Böyle bir yaklaşıma çevrim sıralama denir. PCR’nin döngü dizilemede dideoksi yöntemiyle kullanılması, dizilemenin duyarlılığını büyük ölçüde geliştirdi. Döngü dizilimi, birçok yönden standart DNA dizileme reaksiyonuna benzer. Tampon, şablon, primer, dNTP’ler ve ddNTP’lerden oluşan standart bir sıralama reaksiyon karışımı ile başlar.
Termostabil DNA polimeraz, standart polimerazın yerini alır. Bu karışım, bir amplifikasyon reaksiyonunun olağan denatürasyon, tavlama ve uzatma aşamalarına tabi tutulur. Şablonu üstel olarak çoğaltmak için iki primer kullanan normal bir DNA amplifikasyonunun aksine, döngü dizileme, uzatma ürünlerini lineer olarak çoğaltmak için yalnızca bir primer kullanır. Reaksiyonun tekrarlanan döngüsü nedeniyle, döngü sıralaması için eski dideoksi yöntemlerine göre daha az şablon gerekir.
Ek olarak, sıcaklık döngüsü sırasında her primer tavlama adımından önce çift sarmallı şablonun denatüre edilmesiyle, DNA dizilimi için tek sarmallı şablonlar hazırlama ihtiyacı ortadan kalkar.
Ayrıca, çift sarmallı şablonlar, DNA’nın her iki sarmalının dizilenmesine izin verme avantajına sahiptir. Bu dizileme yaklaşımı, geleneksel dizileme yaklaşımlarından çok daha fazla otomasyona uygundur.
Otomatik Sıralama
Dizileme teknolojisinin verimi, insan genom projesi gibi büyük ölçekli dizileme projelerinde hız sınırlayıcı ana adımdı. DNA dizileme teknolojilerindeki en önemli ilerleme, tekniğin otomasyonu olmuştur.
Bu, yukarıda bahsedildiği gibi, büyük ölçüde üç ana alanda meydana geldi: florofor kimyalarındaki gelişmeler, giderek daha fazla ısıya dayanıklı polimerazın keşfi ve PCR tekniğinin gelişimi.
Nükleik asitlerin dizilenmesinin başlangıcında, radyoizotopik işaretleyiciler, fragmanların saptanması için tek yöntemdi ve bu tür etiketli fragmanlar, akrilamid jelleri ile ayrıldı ve izotopik bantlar, otoradyografinin ardından görselleştirildi. Her şablon için dört reaksiyon, A, C, G ve T gerekliydi ve reaksiyonlar daha sonra jel üzerindeki bitişik şeritlere yüklendi.
Ayırma ve otoradyografinin ardından, dizi, otoradyografın altından üstüne bant deseni “okunarak” belirlendi; bu, jelin çözme gücü sınırlayıcı hale gelene kadar sürekli artan uzunluktaki parçaları temsil ediyordu.
Excel otomatik sıralama
Excel otomatik sıralama makrosu
excel’de büyükten küçüğe sıralama makrosu
Excel otomatik sayı doldurma
Excel sıralama Kısayol
Excel sıralama özellikleri
Excel 1 2 3 4 5 sıralama
Excel seri no oluşturma
Her bir şablon reaksiyonu için dört şerit kullanma gerekliliği, aynı anda bir jel üzerinde işlenebilen numune sayısındaki büyük bir sınırlamaydı ve ayrıca yüksek seviyede şablon gerektirdi. Otoradyografların manuel olarak okunması, otomasyon öncesi günlerin tanık olacağı gibi, uzun ve sıkıcı bir işti.
Manuel okuma, hem X-ışını filmindeki verilerin yorumlanmasında hem de otoradyograftaki diziden bir kağıt parçasındaki diziye veya doğrudan bir bilgisayara yazılan diziye yapılan transkripsiyon hatalarında insan hatasına oldukça yatkındır. Çoğu durumda, elde edilen X-ışını filmleri doğrulama için iki kişi tarafından okundu ve DNA dizisi gerekliydi ve her iki DNA zincirinde gerçekleştirilen reaksiyonlardan karşılaştırıldı, karşılaştırma için hem ileri hem de geri diziyi verdi.
Mevcut otomatik yöntemler, manuel poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile maksimum 300-500 baz/gün ile karşılaştırıldığında, günde 2 milyona kadar baz üretme kapasitesine sahiptir. Dizileme kimyası, özellikle Sanger zincir sonlandırma metodolojisi daha sağlam hale geldikçe, reaksiyonlar için DNA şablonu gereksinimleri daha az talep edilmektedir.
Sıralama işleminin otomasyonu için hayati gelişme, sıralama merdiveninin tespiti için molekül olarak floresan raportör boyaların kullanılmasından kaynaklandı. Boyaların jelden geçerken lazerle uyarılması ve floresan parçacıklarının gerçek zamanlı olarak doğrudan optik tespiti ile bağlantılı olarak, veri toplamanın tam otomasyonu mümkün hale geldi.
DNA parçalarının ayrılması için iki ana otomasyon stratejisi vardır; ince levha jeli ve kılcal jel elektroforezi. Otomatik sıralayıcıların ilk nesli, entegre floresan algılama sistemlerine sahip bir elektroforez tankında çalıştırılan uzun dikey poliakrilamid jellerden oluşuyordu.
Floresan olarak etiketlenmiş parçalar, sıralama jelinin altındaki dar bir pencereden geçen bir lazer ışını ile uyarılır. Floresan verileri daha sonra toplanır ve sanal bir jel görüntüsü oluşturulur. Jel elektroforezinde ayırma süreleri, daha yüksek voltajlar kullanılırsa ve bir ayırma ortamı olarak ultra ince jeller kullanılırsa önemli ölçüde de azaltılabilir.
Jel bazlı sıralamanın yerini alan ikinci ve şu anda en yaygın olarak kullanılan strateji, ince sıvı polimer dolgulu kapiler tüpler kullanır. Değişken çaplarda ve uzunluklarda ince duvarlı kapilerler, etiketli DNA fragmanlarının hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir, böylece standart jel elektroforetik teknikleriyle karşılaştırıldığında ayırma sürelerini 25 kata kadar da azaltır.
Otomatik kılcal sıralayıcılar şu şekilde çalışır: otomatik bir şırınga sürücüsü kılcal damarı polimerle yavaşça doldurur, sıralama reaksiyonlarını içeren otomatik numune tepsisi, kılcal damarın tepsideki belirli bir numuneye daldırılacağı şekilde hareket eder ve küçük bir kısım sıralama reaksiyonunun kapiler içine de çekilir.
Daha sonra, tüm DNA parçaları çözülene ve optik pencereyi kapilerin sonuna doğru geçene kadar bir akım uygulanır. Bir lazer floresan olarak etiketlenmiş parçaları uyarır ve bir CCD kamera sonraki analizleri için floresan verilerini toplar. Numuneler arasında, bir sonraki sıralama reaksiyonu için işleme devam etmeden önce kapiler taze polimer ile de yeniden doldurulur.
Kapiler sıralayıcılar, slab jel sıralayıcılardan daha fazla verime sahiptir ve sıkıcı jel hazırlama ve yükleme adımlarını ortadan kaldırır. İlk ticari kapiler sıralayıcılar 2000’in başlarında piyasaya çıktı. Mevcut bir sıralayıcı, yüksek verimli sekans analizi için paralel olarak çalışan 96 kapilere sahiptir. Bu sistem 24 saatte 2 milyon bp’ye kadar DNA’yı analiz etme yeteneğine de sahiptir.
Excel 1 2 3 4 5 sıralama Excel otomatik sayı doldurma Excel otomatik sıralama Excel otomatik sıralama makrosu Excel seri no oluşturma Excel sıralama Kısayol Excel sıralama özellikleri excel'de büyükten küçüğe sıralama makrosu