DNA Dizileme Tarihi
1960’ların ortalarında Robert Holley’in grubu tarafından kısa tRNA şablonları üzerinde dizileme tekniklerine yönelik ilk girişimler yapıldı. Bu yöntem, RNA’nın diziye özgü RNazlarla sindirilmesini ve ortaya çıkan ribonükleotitlerin iyon değişim kromatografisiyle ayrılmasını içeriyordu.
1970’lerin başında rutin DNA dizileme, DNA kısıtlama enzimlerinin, esasen karmaşık genom şablonlarını kesmek için moleküler makasların ve şablon fragmanlarının in vitro kopyalanmasını sağlayan DNA polimerazların keşfi ve izolasyonu ile bir gerçeklik haline geldi. Bu enzimler, küçük DNA fragmanlarının çok daha büyük dizilerden izole edilmesini ve daha sonra yeni etiketli veya etiketli DNA’nın in vitro sentezi için şablonlar olarak kullanılmasını sağladı.
1980’de üç bilim insanı, iki DNA dizileme yönteminin bağımsız gelişimi için kimyada Nobel ödülüne layık görüldü. Bunlar, DNA dizilimi için kimyasal bir yöntem geliştiren Maxam & Gilbert ve DNA dizilimi için enzimatik bir yöntem tanımlayan Fred Sanger idi. Bu tekniklerin her ikisi ve bunlara yapılan modifikasyonlar, dideoksi zincir sonlandırma yönteminin (Sanger) baskın olduğu günümüz dizileme teknolojilerinin çoğunun bel kemiğidir.
DNA’nın kimyasal dizilimi
İzole edilmiş bir DNA bölümünün nükleotid dizisini belirlemenin en eski yöntemlerinden biri, daha çok Maxam-Gilbert tekniği olarak adlandırılan ve 1977’de yayınlanan DNA zincirinin kimyasal dizilimiydi. Bu yöntemde, izole edilmiş bir DNA fragmanı radyoetiketlidir. bir uçta ve daha sonra etiketli şablonu bir dizi baza özgü bölünme reaksiyonuna tabi tutarak kısmen bozunur.
Bu bölünme reaksiyonları, ortak bir noktadan (radyoetiketli terminal) kimyasal bölünme bölgesine uzanan beş radyoetiketli molekül popülasyonu üretir.
Koşullar, belirli bir DNA zinciri içinde ortalama olarak her molekülde yalnızca bir hedef baz modifiye edilecek şekilde tasarlanmıştır ve bu reaksiyonlar iki aşamada gerçekleştirilir: (a) belirli bazlar veya baz türleri kimyasal modifikasyona uğrar; ve (b) modifiye baz şekerinden çıkarılır ve modifiye baza 50 ve 30 fosfodiester bağları bölünür.
DNA’yı belirli bazlarda parçalayan ayrı reaksiyon tüplerinde beş farklı kimyasal modifikasyon meydana gelir. Spesifik kimyasal reaksiyonların her birinin ardından, tüpteki şablon, daha sonra hasarlı DNA’ya bitişik fosfodiester bağlarını parçalayan piperidin ile işlenir.
dna dizi analizi 1-5 reaksiyon nedir
DNA Dizileme
DNA dizi analizi fiyatları
Dna sekansı Nedir
Dna dizi analizi ilk kez kaç yılında yapılmıştır
Dna dizi analizi ne ise yarar
dna dizi analizi 1-10 çift nedir
DNA dizi analizi ilk kez
Uzunlukları bir ila birkaç yüz nükleotid arasında değişebilen, sonuçtaki uç etiketli moleküller seti, birbirinden tek bir parça boyutunda değişen bir ‘merdiven’ parça vererek tek tek bazların konumunu belirlemek için kullanılabilir. baz.
Bu parçalar, bir poliakrilamid jel aracılığıyla jel elektroforezi ile ayrılır ve dizi, dizileme jelinin bir otoradyogramından okunur. Bu Maxam-Gilbert yönteminin aralığı, tek bir reaksiyon kümesinden en fazla 600 bp’lik sekans oluşturulduğundan, Sanger yönteminden daha azdır.
Bu yöntemin kullanımı, büyük ölçüde otomasyon ve kişiye özel DNA polimerazlar dahil olmak üzere enzimatik dizileme yaklaşımlarındaki muazzam gelişmeler nedeniyle son yıllarda önemli ölçüde azalmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım birçok laboratuvarda çok önemli bir rol oynamaya devam eder ve oligonükleotid dizilerinin dizilerini oluşturmak için ve transkripsiyonel kontrol sinyallerinin fonksiyonel diseksiyonunda kullanılır.
DNA dizilemenin dideoksi yöntemi
DNA dizilimi için Sanger veya zincir sonlandırma yöntemi, büyük genom girişimleri tarafından kullanılan yaklaşımdır. Bu yöntemin prensibi basittir; izole edilmiş bir DNA parçası veya tüm plazmit, kozmit veya PCR ürünü, ısı veya alkali muamelesi ile tek iplikli formuna denatüre edilir.
Kısa bir sentetik oligonükleotit primeri, tek sarmallı şablonlardan biri üzerinde kodlanan tamamlayıcı dizisine tavlanır. Primer/şablon dupleksinin 30 ucu daha sonra polimeraz eylemi için başlangıç bölgesi olarak kullanılır ve öncü olarak dNTP’ler kullanılarak tamamlayıcı bir DNA zinciri sentezlenir.
Zincir sonlandırma kimyası, etiketli oligonükleotit primerleri ile birlikte veya uzatma reaksiyonu sırasında etiketli nükleotitlerin dahil edilmesiyle kullanılmıştır. Boya primerleri ile sıralamada, her numune için dört ayrı sıralama reaksiyonu gerçekleştirilir, her reaksiyon farklı bir boya etiketli primer içerir.
Bu yöntem, evrensel primerleri kullanan projeleri sıralamak için çok uygundur; bununla birlikte, özel yapım primerler kullananlar, her bir primerin dört ayrı boya etiketleme reaksiyonunda modifiye edilmesi gerektiğinden, daha hantal ve pahalı hale gelir.
Standart zincir sonlandırma sıralama yaklaşımında, dört ayrı sentez reaksiyonu gereklidir. Bireysel reaksiyonların her biri, bir OH grubu yerine bir hidrojen atomunun bağlanmasıyla deoksinükleotitlerden farklı olan dört 20,30 dideoksinükleotit trifosfattan (ddNTP) birinin küçük bir miktarını içerir.
Sentezlenmekte olan DNA’nın büyüyen ipliği spesifik bir ddNTP içerdiğinde, ddNTP, polimerazın sonraki dNTP ile bir fosfodiester bağı oluşturmak için ihtiyaç duyduğu 30-hidroksil grubundan yoksun olduğundan, uzama reaksiyonu sona erer.
Dört reaksiyonun her birinde ddNTP’nin dNTP’ye oranının dikkatli bir şekilde kontrol edilmesiyle, ddNTP’lerin her birinin büyüyen DNA iplikçiklerine rastgele fakat düşük düzeyde dahil edilmesi sağlanır ve ortak bir 50 ucu olan bir dizi fragman oluşturulur. primer tarafından, ancak spesifik ddNTP’nin dahil edilebileceği her olası pozisyonda sonlanır.
Bu tür zincirlerin ortalama uzunluğu, tüm ürünlerin poliakrilamid jel veya kapiler elektroforez ile kolayca çözülebilmesini sağlamak için ddNTP:dNTP oranları değiştirilerek manipüle edilebilir.
Her biri mevcut dört ddNTP’den biri ile dört reaksiyon gerçekleştirerek ve daha sonra A-, C-, G- ve T-sonlandırılmış dört reaksiyonu bir çözücü jel üzerinde yan yana veya kılcal elektroforez ile çözerek , yine dizinin okunmasını sağlayan karakteristik fragman merdivenini üretiyoruz.
Yaygın etiketleme stratejileri, flüoresan veya radyo-etiketli dNTP’lerin dahil edilmesini, ardından kapiler elektroforezi, otoradyografiyi veya sonlandırılan ürünlerin kemilüminesan tespitini içerir. Bu teknikte, büyük ölçüde florofor kimyasındaki gelişmelere bağlı olarak büyük ilerlemeler kaydedilmiştir.
Artık ddNTP’lerin her birini farklı boyalarla etiketlemek mümkündür, bu da sıralama reaksiyonunun tek bir tüpte tek bir primer ile gerçekleştirilmesini sağlayarak önemli ölçüde zaman ve maliyet tasarrufu sağlar. Şu anda, biri diklororodamin boyaları içeren (dRhodamine Terminator, Applied Biosystems) ve diğeri BigDyes’i (BigDye terminator, Applied Biosystems) içeren iki tip boya sonlandırıcı mevcuttur.