Mutasyon Algılama – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Mutasyon Algılama ve Doğrulama
DNA dizilimi
CSGE ve CMCD gibi tarama yöntemleri, yalnızca genin küçük bir alanındaki moleküler değişikliğin konumunu ve bazen türünü ve mutasyonların bulunabileceği yerleri belirler. Ancak mutasyonun gerçek doğası ancak doğrudan DNA dizilimi ile belirlenebilir.
Sıralama için gerekli olan tek iplikli DNA PCR ürünlerinin hazırlanmasına ilişkin eski yöntemler (uygun biyotinlenmiş primerler ve streptavidin kaplı manyetik boncuklar veya asimetrik PCR kullanılarak) artık döngü dizilimi ile değiştirilmiştir.
Bu yöntem, özel bir termostabil Taq enzimi ve floresanla işaretlenmiş dideoksi-dNTP’ler kullanılarak bir döngü dizileme işleminde az miktarda orijinal çift sarmallı şablondan yeni bir DNA sarmalının sentezine dayanır. 16-96 kapiler elektroforez sistemli otomatik genetik analizörlerin kullanıma sunulmasıyla artık günde yüzlerce dizileme yapmak mümkündür.
Bir mutasyonun saptanmasının ardından, bölgeye yönelik mutajenez ve bir hücre hattı kültüründe ekspresyonu veya aşağıdaki yöntemlerden biri ile kimliği doğrulanabilir:
1. Kısıtlama endonükleaz analizi. Tek bir baz çifti ikamesi, bir kısıtlama endonükleaz enzim bölgesini oluşturabilir veya yok edebilir. Böyle bir değişikliğin doğrulanması için, yüzlerce uygun kısıtlama enziminden biriyle ilgili PCR ürünlerinin kısıtlama ürünleri, agaroz veya akrilamid jel üzerinde elektroforez ile analiz edilebilir ve kısıtlı DNA bantları, etidyum bromür boyama ile görselleştirilebilir. Tip 2NVWD’de rapor edilen mutasyonların neredeyse tamamı bu şekilde tespit edilebilir.
2. Alel-spesifik oligomukleotid (ASO) hibridizasyonu. Değişikliği tespit etmek için kısıtlama enziminin bulunmadığı mutasyonlarda, ASO-H veya nokta-blot analizi kullanılabilir. Burada vahşi tip ve mutant dizilere sahip kısa bir oligonükleotit (yaklaşık 15 bp) sentezlenir. İlgili eksonun saflaştırılmış PCR ürünleri NaOH içinde denatüre edilir. Uygun ekzondan alınan normal ve hastanın PCR ürünleri, Hybond Nþ naylon şeritlere (Amersham International), manuel olarak veya piyasada bulunan aparatlardan biri kullanılarak uygulanır.
Naylon filtre şeritleri daha sonra DNA polimeraz I Klenow fragmanı (Pharmacia) kullanılarak 32P-ATP ile etiketlenmiş iki farklı tipte oligonükleotit ile hibritlenir. Hibridizasyonlardan sonra, filtre şeritleri, her ASO probu için ampirik olarak belirlenen optimal bir sıcaklıkta 10-20 dakika boyunca SDS ile farklı SSC konsantrasyonlarında üç kez yıkanır. Otoradyografiyi kullanarak, pozitif (tavlanmış) ve negatif (tavlanmamış) numuneleri görselleştirmek mümkündür.
Şu anda, veri tabanında tip 2A VWD’ye neden olmak için en az 40 hatalı mutasyon, dört küçük silme ve bir ekleme listelenmiştir. Nadir bir baskın tip 2A VWD formunun (resmi olarak tip IID), karboksil terminal CK alanında bir yanlış anlamlı mutasyona sahip olduğu bulundu. Tip 2B VWD’den sorumlu bir dizi yanlış anlamlı mutasyon şimdi tanımlanmıştır ve bunların tümü, GPIb için fonksiyonel bağlanma alanını içeren VWF’nin 2A alanında gruplandırılmıştır.
Nonsense mutasyon Nedir
Silent mutasyon Nedir
Anlamsız Mutasyon nedir
Missense mutasyon Nedir
Transversiyon mutasyon Nedir
Mutasyon çeşitleri
Yanlış anlamlı mutasyon Nedir
Anlamsız mutasyon
Birkaç istisna dışında, bunların hepsi kısa bir peptitle sınırlıdır (amino asitler 540-578). En sık görülen mutasyonlar, tip 2B VWD’lerin yaklaşık %90’ını oluşturan R1306W, R1308W, V1316M ve R1341Q’dur. 18-24 eksonları ile ilişkili D0 ve D3 alanlarındaki on beş hatalı anlamlı mutasyon, şu anda tip 2N VWD veri tabanında görünmektedir, çoğunluğu R854Q hatalı anlamlı mutasyondur.
Tip 1 ve 3 için mutasyonlar VWF geninin 52 ekzonunun herhangi bir bölümünde mevcut olabileceğinden, bu VWD tiplerinde mutasyon tespiti yavaştı ve 1990’ların başında büyük silmelere sahip sadece bir avuç dolusu rapor edildi. Bununla birlikte, doğrudan DNA dizilemesinin tanıtılması ve göreceli kolaylığı ile, akraba evliliği olan ailelerden gelen hastalarda çoğunlukla homozigot formda tip 3 VWD için çok sayıda mutasyon rapor edilmiştir.
Çok merkezli bir Avrupa (MCMDM-1VWD) çalışmasının ve tip 1 VWD’nin teşhisi ve tedavisine ilişkin bir Kanada çalışmasının sonucu olarak, şimdi çok daha fazla mutasyon tanımlanmıştır. Bu sonuçlar, olgun VWF’deki heterozigot yanlış anlamlı mutasyonların tip 1 VWD’nin önemli bir nedeni olduğunu ve diğer birçok mutasyon tipinin VWF ekspresyon seviyelerinin azalmasına neden olabileceğini ve bu tip VWD fenotipine katkıda bulunabileceğini göstermektedir.
Trombosit Araştırmaları
Trombositler, ortalama çapı 1-2 “m ve ortalama hacmi 5-8 fl olan, periferik dolaşımda ortalama ömrü 1-10 gün olan megakaryosit sitoplazmasının küçük parçalarıdır. İşlevleri bütünlüğü korumaktır. damar duvarının zarar görmesi ve vaskülatürdeki hasar üzerine hemostaz başlatmak içindir.
İşlevleri üç ana alana ayrılabilir: vasküler endotelyuma yapışma; birbirine toplama; ve kimyasalların plazmaya salınması. Bu bölüm, bu alanların her birini araştırmak için kullanılan tekniklerin arkasındaki ilkeyi açıklayacaktır.
Klinik durumlarda, bu işlevselliğin kaybı, damar delinmesi veya diş tedavisi gibi küçük travmaları takiben artan morarma, peteşial döküntü veya uzun süreli kanama gösteren hastalarda ifade edilir. Bu problemlerle başvuran hastalar, trombosit sayımının nicelleştirilmesiyle birlikte bir trombosit fonksiyonu ekranına sahip olmalıdır.
Yapı ve İşlev
Trombosit fonksiyonu trombosit yapısı ile yakından ilişkilidir. Trombosit dış zarı, standart bilipid hücre zarını kesen farklı glikoproteinler içeren oldukça işlevsel bir organeldir. Bu glikoproteinlerin birçoğu, normal bir trombosit yanıtında gerekli olan fonksiyonların herhangi birini indüklemek için trombosit içindeki çeşitli biyokimyasal yolları aktive etme yeteneğine sahiptir.
Anormal trombosit fonksiyonunun, bu glikoproteinlerin bir veya daha fazlasının ekspresyonunun eksikliğinden kaynaklandığı gösterilmiştir. Anormal trombosit yapışması, trombosit membran glikoproteini Ib’nin eksik olduğu gösterilen Bernard-Soulier sendromunda görülür.
Bu glikoprotein, plazmaya maruz kaldığında subendotelyal matrisi kaplayan ve böylece glikoprotein Ib aracılığıyla trombositleri vasküler hasar bölgesine bağlayan plazma proteini von Willebrand faktörü için spesifik bir bağlama kapasitesine sahiptir. Kompleks glikoprotein IIb/IIIa’nın eksikliği, trombositlerin kümelenme yeteneğinde bir anormalliğe neden olur.
Bu durum Glanzman trombasteni olarak bilinir. Bu ve diğer glikoproteinler, çeşitli düşük ve yüksek moleküler ağırlıklı trombosit agonistleri için fizyolojik bir reseptör görevi görür. Bu glikoprotein reseptörlerinin bir veya daha fazlası aktive olduğunda, trombositin iç organellerine bir sinyal iletimi olur.
Bu genellikle, ilgili ligandları tarafından aktivasyon üzerine glikoproteinlerin iç uçlarında açığa çıkan enzim fosfolipaz C’nin aktivasyonu yoluyla olur.
Anlamsız mutasyon Anlamsız Mutasyon nedir Missense mutasyon Nedir Mutasyon çeşitleri Nonsense mutasyon Nedir Silent mutasyon Nedir Transversiyon mutasyon Nedir Yanlış anlamlı mutasyon Nedir