Bağlanma Tahlili – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Test ve kontrol kan örneklerinin 800 rpm’de 10 dakika santrifüj edilmesiyle PRP hazırlanır. Süpernatandaki (PRP) trombosit sayısı yaklaşık 250 109/l’ye ayarlanır. Manyetik karıştırma çubuğu içeren küvetlere 200 ml hasta kanı veya normal kontrol (boş) eklenir ve 2 dakika boyunca Bio/Data 4 kanal trombosit agregometresinin 37 C ısıtma bloklarına yerleştirilir.
Her küvet daha sonra agregometrenin kanallarından birine yerleştirilir ve agregasyon başlatılır. Numunelerin her birine 20 ml ristosetin (en zayıf numuneden başlayarak) eklenir. Toplama işleminin en az 3 dakika olmasına izin verilir.
İletilen ışıkla orantılı bir kümelenme deseni izi yazdırılır ve tipik olarak verilir. Tip 2B VWD’den alınan numuneler, karşılaştırılabilir bir toplama modeli elde etmek için normal numunelerden daha az ristosetin gerektirir.
VWF/FVIII Bağlanma Tahlili
VWF ve FVIII yakından ilişkilidir ve plazmada kovalent olmayan bir moleküler kompleks oluştururlar. VWF molekülü üzerindeki FVIII bağlanma alanının bütünlüğü, bunun oluşumu ve VWF/FVIII kompleksinin plazmada stabilitesi ve taşınması için önemli bir faktördür.
Birkaç VWD vakasının araştırılmasında, VWF’nin FVIII’e kusurlu bir bağlanma kapasitesine sahip olduğu ve bu faktörün seviyesinde azalmaya neden olarak hafif hemofili A’ya benzer bir duruma yol açtığı fark edildi.
Bu durum başlangıçta ‘psödohemofili’ olarak adlandırıldı, ancak daha sonra bir VWF anormalliği olarak kabul edildi ve ‘Normandiya’ (ilk tanımlanan hastanın geldiği alandan sonra) veya 2N VWD tipi olarak yeniden adlandırıldı. Bu hastalarda bulunan mutasyon kusurları VWF multimerizasyon mekanizmasını etkilemediğinden, bu VWD varyantındaki VWF:Ag multimerleri normaldir.
Son zamanlarda, VWF içindeki ve bu durumdan sorumlu olan spesifik mutasyonlar, D0 ve D3 alanlarına eşlenmiştir ve mutasyonların çoğu, Arg 19 ve Cys297 arasında 18-24 eksonlarında gruplandırılmıştır.
FVIII’nin VWF’ye bağlanmasını belirlemek için burada açıklanan yöntem Nesbitt ve ark. (1996) orijinal bildirilen yöntemin modifikasyonu. Uygun bir anti-VWF monoklonal antikor konsantrasyonu olan MAS 533p (Sera Lab), gece boyunca 4°C’de mikrotitre plakalarına (Immulon 4, Dynatech Laboratories) bağlanır.
Plakalar, %0.1 BSA içeren 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 (TBS) içinde iki kez yıkanır. 1 U/dl, 0.5 U/dl, 0.25 U/dl ve 0.125 U/dl VWF:Ag içeren hasta plazmasının seri dilüsyonları, %3 BSA içeren TBS’ye eklenir ve tekrar gece 4 C’de inkübe edilir.
Bağlanma stilleri
Bağlanma stilleri Testi
Yetişkin bağlanma stilleri Testi
BAĞLANMA Testi
Güvenli BAĞLANMA merdiven testi
Kaçıngan bağlanma testi
Bağlanma stilleri Anketi
Güvenli BAĞLANMA Testi
Plakalar daha önce olduğu gibi yıkanır ve numunelerdeki endojen FVIII, oda sıcaklığında 1 saat 0.35 M CaCl2 ile inkübe edilerek çıkarılır. 10 mM CaCL2 ve %0.002 Tween 20 ile TBS/%1 BSA içinde seyreltilmiş 0,05 U/ml’de rekombinant FVIII (Bioclate, Baxter) eklenir ve 2 saat süreyle 37°C’de inkübe edilir. Yıkandıktan sonra VWF’ye bağlı FVIII, Coamatic FVIII Kromojenik kit (Quadratech) kullanılarak belirlenir ve 405 nm’de saptanır.
Sonuçlar, FVIII bağlanması için 405 nm’de absorbansa karşı VWF:Ag seyreltisi (%) olarak çizilir. Burada verilen örnekte, pozitif kontrol olarak Thr28Met mutasyonuna sahip normal bir kontrol, bir homozigot ve iki heterozigot (P1 ve P2) tip 2N VWD hastasından örnekler kullanılmıştır. Herhangi bir anormal sonucun belirlenmesi için bir dizi normal kontrol numunesi kullanılmalıdır.
Mutasyon Tanımlaması İçin Genotipik Testler
Mutasyonlar için tarama
VWD’nin tüm tipleri ile ilişkili mutasyonlar 1980 sonlarından beri tanımlanmıştır. Bununla birlikte, VWF geninin büyük boyutu ve karmaşıklığı ve büyük delesyonlar hariç tutularak 22. kromozomda psödojenin varlığı nedeniyle, genellikle daha az bilgi olmuştur. Tip 1 ve tip 3’teki moleküler kusurlar hakkında, tip 2 VWD’ye göre bakılır.
2A, 2B, 2N ve 2M alt tiplerinden sorumlu mutasyonların araştırılması daha başarılı olmuştur ve bunlar fenotip çalışmalarının sağladığı ipuçlarından kaynaklanmaktadır. A2 alanı içinde, Try842’den Met843’e bölünme bölgesine yakın bir proteaz duyarlı bölgenin, 2A VWD’de görülenlere benzer yapısal değişiklikleri indüklediği bildirildi ve bu alan, 2A VWD’de mutasyon tespiti için hedeflendi.
Trombosit GpIb için artan bir afinitenin olduğu 2B VWD’de, mutasyon saptama çalışmaları, GpIb için fonksiyonel bağlanma alanını içeren VWF’nin A1 alanına yönlendirilmiştir. Gerçekten de, VWD’nin bu iki alt tipinden sorumlu olan mutasyonların neredeyse tamamı, VWF’nin A1 ve A2 alanlarını haritalayan ekson 28’de bulunmuştur.
Benzer şekilde, ekson 18-24, tip 2N VWD’de mutasyon tespiti için hedeflenmiştir. VWF’de bulunan çok sayıda polimorfizm ile birlikte VWD’de tanımlanan nokta mutasyonları, eklemeleri ve silmeleri içeren bir veri tabanı 1993’te yayınlandı.
Bununla birlikte, daha fazla bilgi elde edildikçe bu liste sürekli olarak arttığından, İnternette VWD araştırmacılarından oluşan bir konsorsiyum tarafından yeni bir VWF çevrimiçi mutasyon ve polimorfizm veri tabanı oluşturuldu ve sürdürüldü.
Bu site şimdi değiştirildi ve İngiltere’deki Sheffield Üniversitesi tarafından sürdürülen ISTH VWF Bilimsel ve Standardizasyon Komitesi adına yeni bir site oluşturuldu. Bu web sitesi VWF genindeki en son bildirilen mutasyonlar ve polimorfizmler hakkında güncel bilgiler içerir.
Bildirilen bu mutasyonların çoğu, rekombinant VWF’nin, mutasyonun bölgeye yönelik mutajenez ile tanıtıldığı bir hücre dizisi kültüründe eksprese edildiği fonksiyonel çalışmalarla doğrulanmış olsa da, diğerleri henüz eksprese edilmemiştir. Rapor edilen mutasyonların bazılarında, VWF geninin tamamı, başka yerlerde değişiklik olasılığını dışlamak için araştırılmamıştır.
Mutasyonların VWF geninin tüm uzunluğu boyunca herhangi bir yerde bulunabildiği tip 1 ve 3 VWD’de, kimyasal uyumsuzluk klevaj tespiti (CMCD), konformasyonel duyarlı jel elektroforezi (CSGE) veya denatüre gradyan jel elektroforezi (DGGE) ile bir ön tarama ) rapor edildi.
CMCD ile mutasyon taraması için, VWF geninin tamamı, polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) vasıtasıyla periferik lenfositlerde bulunan ‘gayrı meşru’ mRNA’nın ters transkripsiyonu ile elde edilen cDNA’dan yedi segmentte amplifiye edilir.
Bu segmentler daha sonra mutasyon için CMCD ile taranabilir. DGGE, CMCD kadar hassastır, ancak özel primerlerin sentezini ve elektroforez jel tekniğinin kullanılmasını gerektirir. CSGE metodolojisi basit ve radyoaktif olmayan bir tespit yöntemidir; bununla birlikte, VWF gen araştırması için 60’a kadar segmentin amplifikasyonlarını ve analizini içerir.
Bağlanma stilleri Bağlanma stilleri Anketi Bağlanma stilleri Testi BAĞLANMA Testi Güvenli BAĞLANMA merdiven testi Güvenli BAĞLANMA Testi Kaçıngan bağlanma testi Yetişkin bağlanma stilleri Testi