Hangi anti-DNA testi seçilmeli?
İdeal tahlil, hastalık aktivitesini güvenilir bir şekilde yansıtmanın yanı sıra, lupus tanısı için yeterince duyarlı ve spesifik olmalıdır. Açıklanan üç testin tümü, aktif hastalığı olan hastalarda >%90 duyarlılıkla birinci kriteri karşılar. Özgüllük açısından, Crithidia ve Farr testleri (özgüllük >%90) ELISA'dan üstündür.
ELISA tahlillerinin, düşük aviditeli antikorları saptama eğilimleri nedeniyle, lupusu olmayan hastaların önemli bir azınlığında yanlış pozitif DNA antikoru sonuçları ürettiği bilinmektedir. Bu dezavantaja rağmen, ELISA tahlilleri, yüksek hassasiyetleri, otomasyon kolaylığı, sonuçları güvenilir bir şekilde nicelleştirme yetenekleri (seri izleme için faydalıdır) ve tahlilde radyoizotop eksikliği nedeniyle klinik uygulamada giderek daha fazla kullanılmaktadır.
Farr testi, hastalık izleme için eşit derecede uygundur ve özellikle böbrekleri içeren hastalık alevlenmelerinin gelişimini öngörmede gerçekten ELISA'dan üstün olabilir.
Yakın zamanda yapılan bir randomize Hollanda çalışmasında, immünosupresif tedavide önleyici artışlar alan anti-dsDNA seviyelerinde %25 artış olan hastalarda, konvansiyonel olarak tedavi edilen kontrol grubuna kıyasla nükslerde önemli bir azalma olmuştur (Bootsma ve ark.).
Lupus hastalarının küçük bir kısmı, DNA antikorlarında eşlik eden bir artış olmaksızın nüks edebilir; benzer şekilde, her üç testte de sürekli olarak yüksek antikor seviyeleri bulunmasına rağmen hastaların az bir kısmı klinik olarak stabil veya asemptomatik olabilir.
Lupus ve Antifosfolipid Sendromu
Fosfolipidlere (APA) karşı antikorlar, tromboz belirteçleri olarak işlev görür ve lupuslu hastaların üçte birinde görülür. 'Antifosfolipid sendromu' (APS) terimi, trombozu ve yüksek fosfolipid antikor seviyeleri olan hastaları tanımlamak için kullanılmıştır. Ağırlıklı olarak venöz trombozla sonuçlanan diğer trombofilik durumların aksine, APS'li hastalarda hem arteriyel hem de venöz damarlarda tromboz gelişebilir.
Klinik belirtiler, hangi organın iskemiye dönüştüğüne bağlıdır. APA, ELISA ile veya fosfo-lipid bağımlı pıhtılaşma tahlillerinin (aktive kısmi tromboplastin zamanı-APTT) uzatılmasıyla saptanabilir.
Asidik bir fosfolipid olan kardiyolipin kullanılarak antijen olarak ELISA ile saptanan APA, enfeksiyon (bakteriyel, viral, protozoal), ilaç tedavisi ve diğer bağ dokusu hastalıkları olan hastalarda birçok yanlış pozitif tanımlandığından, her zaman gerçek bir tromboz belirteci olarak hareket etmeyebilir. Aslında, geçmişteki yanlış pozitif VDRL, VDRL'de bulunan kardiyolipin'e yönelik APA'nın varlığından kaynaklanmaktadır.
Mevcut ELISA testlerinin trombozla ilişkili ve trombozla ilişkili olmayan APA arasında ayrım yapamaması, yüksek APA düzeylerinin klinik önemini yorumlamada zorluklara yol açmıştır.
Antifosfolipid sendromu belirtileri
antifosfolipid sendromu - ekşi
Antifosfolipid sendromu bitkisel tedavisi
Antifosfolipid sendromu gebelik
Sekonder antifosfolipid sendromu
Antifosfolipid sendromu Kadınlar Kulübü
Antifosfolipid sendromu laboratuvar
Antifosfolipid sendromu tanı kriterleri
Bu ayrım önemlidir, çünkü trombozla ilişkili APA'lı hastalar, muhtemelen ömür boyu yoğun, uzun süreli antikoagülan tedaviye ihtiyaç duyarlar. Son kanıtlar, trombozla ilişkili APA'nın, kendi başına fosfolipidlerden ziyade büyük ölçüde 2 glikoprotein I'e (2GPI, fosfolipitleri bağlayan bir serum protein ko-faktörü) yönelik olduğunu göstermektedir.
Mevcut tahlillerde iki 2GPI kaynağı bulunur: ELISA plakalarını bloke etmek için kullanılan insan serumu test numuneleri ve sığır serumu. 2GPI ile immobilize kardiyolipinin etkileşiminin, konformasyonunu değiştirerek immünojenik hale getirdiği düşünülmektedir.
Konvansiyonel ELISA tahlillerinin trombozla ilişkili ve trombozla ilişkili olmayan APA arasında ayrım yapamaması nedeniyle, antijen olarak saflaştırılmış 2GPI kullanan tahlillere büyük ilgi vardır. Varlıkları şu anda antifosfolipid sendromu için tanı kriterlerine dahil edilmemesine rağmen, anti-2GPI antikorları, ELISA ile saptanan geleneksel kardiyolipin antikorlarından daha güçlü tromboz öngörücüleridir.
Fosfolipid bağımlı pıhtılaşma deneylerine müdahale eden APA, bir fosfolipid-protrombin kompleksini tanır ve lupus hastalarında ortaya çıktıklarından dolayı lupus antikoagülanları (LAC) olarak adlandırılır. LAC terimi, kanamadan ziyade in vivo tromboz ile ilişkili olduğu için yanlış bir isimdir.
Normal plazmanın eklenmesiyle düzelmeyen uzamış bir APTT'den LAC'nin varlığından şüphelenilir, bu da bir inhibitörün varlığını düşündürür. LAC antikorlarının gösterilmesi, pıhtılaşmanın işlevsel düzensizliğini gösterdiğinden, bu antikorlar, ELISA tarafından gösterilen APA'ya göre tromboz ile daha yakından ilişkilidir.
Lupuslu hastaların çoğunda kardiyolipin antikorlarının yanı sıra LAC (%70) olacaktır, ancak hastaların az bir kısmında kardiyolipin antikorları veya LAC (her kategoride %15) olacaktır.
Nöropsikiyatrik sistemik lupus eritematozus (NPSLE)
Laboratuvar araştırmasının rolü
SLE'de nörolojik tutulum, hastalıklarının bir noktasında hastaların üçte ikisini etkileyen önemli bir sorundur. Bu tür hastaların yaklaşık %20'si bunu aktif sistemik hastalık zemininde yaparken, vakaların çoğunda sistemik hastalık sessizdir veya sadece hafif derecede aktiftir.
SLE ve nörolojik özellikleri olan bir hastayla karşı karşıya kalan hekim, doğrudan lupus (birincil) nedeniyle nörolojik hastalık, ikincil neden olarak fırsatçı enfeksiyon ve steroid psikozu arasında önemli bir ayrım yapmalıdır, çünkü çoğu hasta o sırada immünosupresif tedavide olacaktır. sunumun.
Altta yatan çok sayıda patojenik mekanizmayı yansıtan çok çeşitli klinik sunumlar görülmektedir. Çeşitli klinik sunumları açıklamak için en az üç hipotez öne sürülmüştür: anti-nöronal antikorlar, fosfolipid antikorlarla ilişkili tromboz ve sitokin kaynaklı hastalıktır.
Ne yazık ki, şu anda mevcut olan SLE laboratuvar belirteçlerinin hiçbiri birincil nörolojik lupus tanısı için yeterince spesifik değildir. Birkaç çalışma, serum veya beyin omurilik sıvısındaki (BOS) anti-DNA ve kompleman (C3, C4) düzeylerindeki anormalliklerin, SLE'de nörolojik ve nörolojik olmayan hastalık arasında ayrım yapmadığını göstermiştir.
Nöronlara (beyin dokusu ile çapraz reaksiyona giren lenfositotoksik antikorlar ve doğrudan nöronal antijenlere karşı hedeflenen antikorlar) karşı yönlendirilen antikorlar için başlangıçtaki istek, nörolojik tutulum olmayan lupus hastalarında varlıklarını gösteren çalışmalarla, nörolojik lupus için spesifik belirteçler olarak azaltılmıştır.
Aynı şekilde, ribozomal P proteinlerine karşı yönlendirilen antikorların, lupus psikozunun spesifik belirteçleri olduğu yönündeki son iddialar, psikozu olmayan SLE hastalarının %50'ye varan kısmında gösterilerek çürütülmüştür.
NPSLE gibi görünen enfeksiyon vakalarının teşhis edilebilmesi için tüm nöropsikiyatrik SLE hastalarında BOS muayenesi zorunludur. SLE'de nörolojik tutulumla ilgili yakın tarihli bir prospektif çalışmada, vakaların yaklaşık %50'sinde altta yatan neden enfeksiyon (kriptokok, tüberküloz ve piyojenik menenjit) olmuştur.
Yalnızca BOS'ta oligoklonal bantların varlığı birincil NPSLE'yi destekler ancak enfeksiyonla da ortaya çıkabilir. Spesifik bir laboratuvar belirtecinin yokluğunda, NPSLE tanısı büyük ölçüde geleneksel klinik sezgiye bağlı kalır.
Elüsyon, spesifik ligand rekabeti ile veya mobil faz parametrelerinin değiştirilmesiyle indüklenen ligand-bağlayıcı kompleksinin tersine çevrilebilir konformasyonel değişiklikleri ile gerçekleştirilebilir.
Bu prosedür, numunenin elüsyonuna ve ligandın aktivitesinin geri kazanılmasına izin verir. Bağın liganda bağlanması muhtemelen bir polimer için çok değerlikli olacaktır (yani çok bölgeli bağlantı) ve bu nedenle sterik olarak bağımlı olabilir.
Tutulmayı etkileyen kritik özellikler, ligand-bağ kompleksi için ayrışma sabiti (Kd) ve durağan fazdaki ligand konsantrasyonudur (bağlanma yerlerinin sayısı). Ayrışma sabiti (Kd), kütle eylem oranı ile tanımlanır.
Afinite kromatografisi için kapasite faktörü (k ‘), basitçe, belirli bir kolon için bağlanmanın serbest bağlantıya oranı olarak tanımlanır ve denklem ile gösterilebilir.
Kd ve k ’arasındaki bir ilişki, analitik ayrımlarda olduğu gibi [Ln]> [Lt] olduğunda türetilebilir. Bu ilişki, çok değerlikli bağlanma için dikkate alınmıştır. Plaka yüksekliğinin K’ye bağımlılığı, concanavalin A’nın eklendiği bir silika desteği kullanılarak not edilmiştir.
Sabit Faz Etkileri
Ligand bağlanmasının kimyası
Ligandların geleneksel sabit fazlara bağlanması için çeşitli yayınlanmış yöntemler mevcuttur ve yüksek performanslı afinite kromatografisi için uygun olan sabit fazların çoğu, bu yöntemlerden bazıları kullanılarak hazırlanmıştır.
Çoğu prosedürde, silika, daha sonra bir reaktif aminin kovalent olarak bağlanabildiği hidrofilik bir tabaka (glikofaz) ile kaplanır. En kararlı destekler ya epoksilika birleştirme ya da tresil-klorür ile aktive edilmiş silika tarafından üretilir.
Diğer özellikler
Parçacık şeklindeki gelişmeler kütle aktarım hızını iyileştirirken desteğin artan sertliği elüsyon ve yeniden dengeleme sırasında daha hızlı akış hızlarına izin verdi. Başarılı ayırmaların çoğunun, sabit faz için bir temel olarak geniş gözenekli (50-100 um) silika partiküllerini kullandığını ve böylece herhangi bir sterik engelden kaçındığını belirtmek de gerekir.
Geleneksel destekler üzerinde yapılan ilk çalışmalardan, bir ara kolun varlığının, muhtemelen ligandın reaktif bölgelerine erişim özgürlüğüne izin vererek bağın bağlanması için faydalı olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, bu kollar ligandın bağlanmasına katılmamalıdır ve bu nedenle hem hidrofilik hem de iyonik olmamalıdır.
Konvansiyonel afinite desteklerinde yüksek derecede ligand ikamesi sağlanabilmesine rağmen, bazı durumlarda bağlanma sırasında yanlış yönlendirme ve denatürasyon kombinasyonundan dolayı potansiyel bölgelerin sadece% 1-2’sinin bağlanma için mevcut olabileceği tahmin edilmiştir.
Ek olarak, durağan faza bağlanabilen molar ligand miktarı, moleküler boyutun bir fonksiyonudur. Bu, bu tür sabit fazın kapasitesinin, iyon değiştirme veya ters faz sabit fazlardan 100 kat daha az olabileceği anlamına da gelir.
İmmünoafinite durağan fazların hazırlanması için bildirilen durumlarda ligand genellikle 5-10 mg / g reçine konsantrasyonunda bağlanır, ancak bir çalışmada alkol özellikle Cibacron Blue FG3-A’dır.
Bu molekül, enzimlerin katalitik aktivitesi için gerekli nükleotid kofaktörlerinin çoğunu taklit ettiği düşünülen sülfonatlı bir antrakinon parçası içerir.
Ham maya ekstrelerinden, ilgili substratları kullanılarak seçici elüsyonla izole edilen iki enzim, heksokinaz ve 3-fosfogliserat kinaz için bu tip desteğin çözülme gücünün dramatik bir kanıtı gösterildi.
Afinite kromatografisi
Hidrofobik etkileşim kromatografisi
İyon değiştirme kromatografisi
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Jel Filtrasyon kromatografisi
Kromatografik yöntemler
Adsorpsiyon kromatografisi
Kolon kromatografisi
İmmünoafinite
Poliklonal antikor preparatlarının çoğu, Kd = lop8 ila lo – ‘* M sırasıyla ayrışma sabitlerine sahiptir. Bu, maksimum seçiciliğe izin verirken, ligand-bağlayıcı ayrılması, kromatografi sırasında hız sınırlayıcı hale gelebilir, dolayısıyla HPLAC’de kullanımları, hızın gerekli olduğu yerlerde avantajlı olarak kabul edilmeyebilir.
Başarılı bir kromatografiye izin vermek için 0,05-0,1 ml / dk mertebesindeki akış hızları gerekli olabilir ve bu, antikor ligandlarının yüksek performanslı desteklere bağlanma amacını ortadan kaldırabilir. Daha düşük bağlanma sabitlerine sahip monoklonal antikorları seçme olasılığı, tercih edilen bir alternatif sunabilir.
Tablo 9.1, ticari olarak iki sınıfa ayrılan daha popüler afinite ligand tiplerini göstermektedir: katı bir şekilde biyospesifik olarak kabul edilenler ve yapısal veya fonksiyonel bir homolojiyi paylaşan molekülleri ayıranlar. Afinite ligandlarının kapsamlı bir listesi başka bir yerde sunulmuştur, ancak liste sürekli olarak büyümektedir.
Mobilephase efektleri
Seçicilik, nihai olarak ligand-bağ etkileşiminin özgüllüğü ile belirlenir. Bağlanma büyük ölçüde stereospesifik etkileşimler tarafından yönetilse de, Kd elektrostatik, hidrofobik ve bu tür diğer etkileşimlere bağlı olacaktır ve bu nedenle pH ve iyonik kuvvet gibi mobil faz özelliklerinden de etkilenecektir.
Ligand-bağ etkileşiminin kinetik çalışmaları, ligandı birleştirmek için kullanılan farklı yöntemlerden veya ligandın destekten sızmasına bağlı olabilecek çelişkili sonuçlar göstermiştir. (Ligandın destekten sızması, farmakolojik olarak aktif bileşiklerin üretimi için büyük ölçekli afinite desteklerinin kullanımında bir dezavantaj olmuştur.) Kd üzerindeki çözüm çalışmaları, sıcaklık arttıkça Kd’de bir artış olduğunu göstermektedir. ve buna karşılık gelen k ‘değerinde bir azalma olur.
Yüksek Performanslı Ligand Değişim Kromatografisi (HPLEC)
Yüksek performanslı ligand değişim kromatografisinin (HPLEC) geliştirilmesi, HPLAC’den oldukça farklıdır. İvmenin çoğu, amino asitlerin rasemik formlarını ayırma girişimlerinden de kaynaklandı.
Bir yaklaşım, amino veya karboksil grubunun modifikasyonu ve ardından normal faz kromatografisi yoluyla amino asitleri diastereomerik karışımlara dönüştürmekti. Popüler türevlendirme ajanları, izotiyosiyanat ve tiyoüre bileşikleridir.
Halen popüler olmasına rağmen, bu yaklaşım reaksiyon sırasında uzun türetme ve olası artefakt oluşumu dezavantajına sahiptir. Diğer bir yaklaşım, normal veya ters faz kromatografisi sırasında da mobil faza bir kiral ajan eklemektir.
Daha yakın zamanlarda, bir kiral ajanın kovalent olarak bağlanması için durağan fazlardan artan şekilde yararlanılmıştır. Aşağıdaki bölümler bunlarla ilgilenecektir.
Prensipler
HPLEC’in en popüler modu, bazen metal şelat kromatografisi olarak anılır. HPLEC’de bir çözünen maddenin (Lt) tutulması, bir metal iyon-bağ kompleksinin oluşumuna bağlıdır.
Metal iyonun kendisi, durağan faz (SM) ile oluşturulan bir koordinasyon kompleksine bağlıdır. Sabit fazın metal iyon bağlayıcı kompleksi (SMLt) tersine çevrilebilir ve oldukça da düzenli bir yapıya sahiptir.