Klonalite Analizi – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Genin yeniden düzenleme çalışmaları ile klonalitenin gösterilmesi
Lenfoproliferatif bozuklukların teşhisi, klonalite ve hücre soyunu göstermek için immünofenotipik yöntemlere dayanmaktadır. B hücre malignitelerinde veya ! hafif zincir kısıtlaması sıklıkla değerlendirilebilir, ancak T hücresi maligniteleri için klonalite daha az kolay belirlenir. T veya B hücrelerinde klonaliteyi saptamak için moleküler biyoloji tekniklerinin kullanılması bu nedenle önemli bir tanısal gelişme olmuştur.
PCR ile B Hücre Klonalite Analizi
B hücresi gelişimi sırasında, fonksiyonel bir birim oluşturmak üzere bir araya getirilen V (değişken), D (çeşitlilik) ve J (birleşme) bölgelerini içeren immünoglobulin ağır zincirinin (IgH) yeniden düzenlenmesi vardır. Normal bir B hücre popülasyonunda, her hücre V, D ve J segmentlerinin farklı bir kombinasyonunu kullanır, ayrıca V–D ve D–J bağlantılarında rastgele sayıda baz çifti eklenir.
PCR yöntemi, biri V segmentlerinin çoğunda bulunan bir konsensüs dizisine karşılık gelen ve diğeri çoğu J segmentinde ortak olan bir konsensüs dizisine karşılık gelen iki primer kullanır. DNA amplifiye edildiğinde, PCR ürününün uzunluğu, VDJ birleştirmesi sırasında eklenen rastgele nükleotidlerin sayısı ile belirlenecektir.
Normal bir B hücresi popülasyonunda, her PCR ürünü biraz farklı bir boyuta sahip olacaktır, böylece PCR ürünleri elektroforez ile ayrıldığında jel üzerinde bir leke görülecektir. B hücrelerinin neoplastik bir popülasyonu durumunda, hepsi aynı VDJ yeniden düzenlemesine sahip olacak ve böylece elektroforez üzerinde ayrı bir bandın görünümü ile görselleştirilen tek boyutlu bir PCR ürünü üretecektir.
PCR ile B hücre klonalite analizinin birçok avantajı vardır. Periferik kan, kemik iliği, taze veya donmuş doku ve parafine gömülü numuneler üzerinde yapılabilir. Çok küçük DNA örnekleri gereklidir ve in situ hibridizasyonda olduğu gibi, sonuçlar geleneksel sitogenetik analizden çok daha hızlı elde edilebilir.
Klonalite nedir Tıp
Klonal Nedir tip
T hücre reseptörü gen yeniden düzenleme çalışmaları
Çoğu olgun T hücresi (TCR) üzerindeki antijen için reseptör, CD3 molekülü ile bağlantılı ve bağlantılı iki polipeptit ve içerir. Daha küçük bir T hücresi popülasyonu, sırasıyla ve zincirleriyle bir homoloji derecesine sahip olan ve olarak adlandırılan iki farklı polipeptitten oluşan farklı bir heterodimere sahiptir. Normal T hücresi gelişimi, heterojen bir T hücresi reseptör gen popülasyonu verecek şekilde bu zincirlerin yeniden düzenlenmesini içerir.
T hücrelerinin klonalitesi, yaygın olarak, TCR lokusu kullanılarak PCR ile değerlendirilir. Bu, incelemek için en uygun tek zincirdir, çünkü olgunlaşmamış T hücre genişlemeleri, bir gen rekombinasyonu sırasında gen silinirken, rekombinasyona uğramamış olabilir.
Genel olarak, TCR zinciri için üç set konsensüs primeri kullanılır ve amplifiye ürünler elektroforez ile ayrılır. Bir poliklonal T hücre popülasyonu, bir PCR ürünleri yayması ile sonuçlanırken, malign T hücrelerinin monoklonal popülasyonu, elektroforetik jel üzerinde görülebilen sadece bir veya iki farklı bant ile gösterilecektir.
Minimal Kalıntı Hastalık Tespiti
Minimal rezidüel hastalık (MDR), ilk remisyon indüksiyon kemoterapisini takiben hayatta kalan malign hücreler olarak tanımlanır. Potansiyel olarak çok küçük bir malign hücre popülasyonunun tespiti, örn. morfolojik olarak remisyonda olan bir kemik iliğinde önemli prognostik ve terapötik etkileri olabilir. MDR’yi izlemek için hem akış sitometrisi hem de moleküler biyoloji teknikleri kullanılmıştır.
Akış sitometrisi ile ilgili temel sorunlardan biri, tümöre özgü bir immünofenotipin tanımlanması olmuştur. Bununla birlikte, bazı hemopoietik antijenler, normal kanda veya kemik iliğinde bulunmayan kombinasyonlarda malign hücrelerde bulunur, örn. T hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) vakalarının çoğunda, malign hücreler nükleer TdT’nin yanı sıra CD3, CD5 ve CD1’i eksprese eder.
Bu model normalde timus dışındaki T hücrelerinde görülmez ve kan veya kemik iliğinde T-ALL hücrelerini göstermek için kullanılabilir. B hücreli ALL ve akut miyeloid lösemi (AML) için MRD analizinde değişen derecelerde başarı ile başka immünofenotipik kombinasyonlar kullanılmıştır.
İmmünolojik tekniklerle ilgili büyük bir sorun her zaman duyarlılıkla ilgili sınırlamalar olacaktır ve akış sitometrisi 104-105 arka plan hücresinde bir hedef hücreyi tespit etme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle rezidüel hastalıkla ilgili çalışmaların çoğu, hedef malignitede bulunan bilinen genetik anormallikleri belirlemek için PCR’nin aşırı duyarlılığını kullanır.
Örneğin, takip eden kemik iliği transplantları da dahil olmak üzere, KML hastalarının takibinde BCR–ABL füzyon genlerinin tespiti yaygın olarak kullanılmıştır.
Lenfoproliferatif bozukluklarda, belirli bir hastanın malign hücrelerine özgü nükleik asit probları ile PCR bazlı analizler için hedef olarak benzersiz klonal yeniden düzenlemeler kullanılabilir.
Bu tür yaklaşımlar emek yoğundur, ancak daha fazla bilgi elde edildikçe, belirli tedavi modaliteleri için prognoz ve uygunluğun değerlendirilmesinde rol oynayacaklardır.
Hemoglobinopatilerin Teşhisi
Moleküler biyolojinin, anormal globin zincir sentezine yol açan spesifik ortak mutasyonların tanımlanmasıyla ilgili olarak derin faydaları olmuştur. PCR, özellikle doğum öncesi tanıda önemli olan hızlı bir tarama testi sağlamak için nokta mutasyonlarının, delesyonlarının ve DNA polimorfizmlerinin saptanması için uygulanmıştır.
Spesifik bir tekniğin seçimi, hastalığın genetik düzeyde tanımlanma derecesine bağlıdır. Örneğin, orak hücre hastalığında, etkilenen gen, DNA dizisi düzeyinde bilinir ve bir hastanın DNA profilini PCR ile amplifiye etmek ve analiz etmek için çeşitli yaklaşımlar alınabilir.
Spesifik nokta mutasyonu bilgisi, hızlı tarama için floresan amplifikasyon tekniklerinin geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Bu yöntemler, normal ve mutant DNA dizileri için kırmızı ve yeşil floresan işaretleyicilerle farklı şekilde etiketlenmiş oligonükleotid primerlerini kullanır.
Her birini etiketlenmemiş ikinci bir primer ile eşleştirerek, PCR ürünleri bir florimetrede farklı kırmızı ve yeşil floresan için analiz edilebilir ve bu da hızlı bir tarama tekniği sağlar.
Talasemi gibi hastalıklarda genler klonlanır ve dizilenir ancak genetik mutasyonlar heterojendir. Bu nedenle kalıtım çalışmalarına yaklaşım, kısıtlama parçası uzunluk polimorfizmlerini (RFLP) kullanan bağlantı çalışmalarına dayanmaktadır.
Bunlar, bir gen ile birlikte kalıtılan ve bu nedenle prenatal tanıda bir mutant genin saptanması için yararlı belirteçler olabilen, genellikle DNA’nın kodlamayan dizilerindeki DNA mutasyonlarıdır.
