Ön Sütun Türevlendirmesi
Sakaritlerin analizindeki ana problemlerden biri, 200 nm'nin üzerindeki dalga boylarında minimum UV absorpsiyonuna sahip oldukları için bunların saptanmasıdır; sonuç olarak, genellikle kırılma indisi (RI) izleme ile tespit edilirler. Pek çok molekül için, RI detektörleri ile mevcut olan sınırlı hassasiyet hem yetersiz hem de pratik değildir ve bu nedenle 254 nm'de daha yüksek absorpsiyona sahip türevler hazırlanmıştır.
Sakaritlerin kolon öncesi türevlendirilmesi, aşağıdaki özelliklere sahip bir türev oluşturmayı amaçlamalıdır: (a) yeniden üretilebilir bir şekilde yüksek verimle hazırlanması kolay; (b) uygun bir dalga boyunda güçlü bir şekilde emer; (c) tercih edilen çözücü sistemleri ile uyumludur; d) prekürsörün kolay geri kazanılmasına izin verir ve (e) daha fazla analiz için uygundur, örn. NMR veya kütle spektrometresi vb.
Ek olarak kimyasal reaktivite ve stabilite sağlanmalıdır. Asetatlar, benzoatlar, 4-nitrobenzoatlar, benziloksim perbenzoatlar, diğer ikame edilmiş benziloksimler, fenildimetilsilil türevleri ve alkillenmiş türevler dahil olmak üzere bir dizi sakarit türevi tarif edilmiştir.
Asit katalizinin yokluğunda, ketozun aksine aldozlarla spesifik olarak reaksiyona girecek olan p-anisidin ile reaksiyon kullanılabilir.
Oldukça düşük konsantrasyonlarda bulunabilen karmaşık oligosakaritlerin analizi için, tritiatlı sodyum borohidrür ile radyoaktif etiketleme kullanılmıştır ve daha doğru ve hassas nicelendirmeye izin verir.
Genel olarak türetme prosedürleri, bileşiklerin polaritesini azaltır ve organik mobil fazlar kullanılarak türevlendirilmemiş silika üzerinde ayrılmalarını kolaylaştırır.
Genel olarak, anomerik formlar, asetilasyon veya benzoilasyondan sonra ayrılabilir, ancak bu anomerik formlar nedeniyle artan pik sayısı, daha uzun elüsyon süreleri gerektirir ve daha karmaşık kromatogramlar verir. Türevleme halkanın açılmasına neden olduğunda tek zirveler elde edilir; bu özellikle oksim reaktiflerinde bulunur.
Monosakkaritler
Disakkaritler nelerdir
Karbonhidratların Sınıflandırılması
Monosakkaritler Nedir
Glikojen nedir
Maltoz
Polisakkarit nedir
Polisakkaritler
Basit Sakaritlerin Ayrılması
Basit sakarit terimi, mevcut bağlamda 1 ila 6 sakarit birimi içeren molekülleri belirtmek için kullanılır ve bu nedenle fruktoz, glikoz, laktoz, maltoz gibi bileşikleri içerir.
Kimyasal olarak modifiye edilmiş alkilamin kolonları
Kimyasal olarak modifiye edilmiş alkilamin kolonları, sakkarit ayrımları için en yaygın olarak kullanılan sabit fazdır ve genellikle asetonitril-su karışımlarından oluşan mobil fazlar ile yıkanır. Bu karışımın metanol-su ve etil asetat-etanol-su gibi diğerlerinden çok daha üstün olduğu bulunmuştur.
Mobil fazın su içeriği arttıkça sakaritlerin tutulmasının azaldığı gözlemlenmiştir. Sütunlar genellikle 3 aya kadar stabildir ancak sonunda amin grupları kaybolur ve tutma süreleri azalır.
Birincil aminlerin indirgeyici sakaritlerle Schiff bazları oluşturma yeteneği, bu sütunların ana sınırlamasıdır, ancak ortak mono- ve disakkaritler için bu bir problem değildir.
İkincil aminler, indirgeyici sakaritlere karşı daha az reaktiftir ve bu nedenle, indirgeyici sakaritlerin ayrıştırılması için ikincil aminler ile modifiye edilmiş sabit fazların kullanılması tavsiye edilir.
Hindiba kökü ekstraktının bir analizi, kimyasal olarak modifiye edilmiş alkilamin kolonlarının, polimerizasyon derecelerine göre sakaritlerin ayrılması için yararlılığını açıkça göstermektedir.
Çözücüdeki asetonitril ve su oranını 60:40'tan 75: 25'e değiştirerek bu sütunlar, ayrı ayrı gıda sakkaritlerinin ayrılmasında önemli ölçüde çok yönlülük gösterir.
Çok benzer bir kolon ve eluent kullanılarak, depolama hücresi duvarlarından gelen monosakkaritler başarıyla ayrılmıştır ve bu nedenle bu tip analiz, nispi besin değerini izlemek için kullanılabilir; Ayrıca, galaktozun glukozdan sıklıkla sorunlu bir şekilde ayrıştırılmasının bu sistemlerle sağlandığı da kaydedildi.
Kimyasal modifikasyon (UV deteksiyonlu ikame edilmiş oksimler) ve kimyasal olarak bağlı bir amin kolonunun kombinasyonu, hem monosakkaritlerin hem de küçük oligosakaritlerin ayrılmasını sağlamak için kullanılmıştır.
Hücre duvarı hidrolizatlarından elde edilen karmaşık bir sakkarit karışımının kimyasal olarak bağlı bir amin kolonu üzerinde ayrıldığı ikili bir kolon sistemi tarif edilmiştir. Çözülmemiş zirvelerdeki sakkaritler daha sonra, ekstraktta bulunan tüm karbonhidrat bileşenlerinin temel ayrımını kolaylaştıran katyon değişim kromatografisi kullanılarak daha da çözüldü.
Fiziksel ve değiştirilmiş amin sütunları
Bu teknikte, silisin basit adsorpsiyonla bir amin kaplaması elde etmesi için mobil faza az miktarda bir alkilamin eklenir. Bu teknik için çok işlevli bir amin, diaminler ve monoaminler de dahil olmak üzere bir dizi farklı amin değiştirici araştırılmıştır ve en yaygın olarak kullanılan değiştirici tetraetilenpentamindir.
Mobil fazda kullanılan tipik tetraetilenpentamin konsantrasyonları 0,018'dir, ancak işlemi hızlandırmak için kolonun% 0,1'lik ilk ön dengelemesi kullanılmıştır. Elüentin yüksek pH'ı (pH 9,2) silikanın çözünmesine neden olabilir ve enjektörden önce bir koruma sütunu tavsiye edilir.
Alternatif olarak, silika kaybının yarattığı boşlukları doldurmak için bir radyal sıkıştırma sistemi kullanılabilir. Bu tür sistemlerin mobil faz, pH, çözücü, amin değiştirici konsantrasyonu ve akış hızı ile ilgili optimizasyonu açıklanmıştır ve bu parametrelerin bir veya daha fazlasını değiştirerek çözünürlük üzerinde mükemmel kontrol elde edilebilir.
63 düşük moleküler ağırlıklı sakkaridin kapsamlı bir incelemesi, radyal olarak sıkıştırılmış fiziksel olarak modifiye edilmiş bir amin kolonunun potansiyelini bir katyon değişim kolonunun potansiyeli ile karşılaştırır ve tüm kapasite faktörlerinin bir listesini içerir.
Eluent içinde çözülmüş çok işlevli bir amin kullanılarak bir silika kolon üzerinde gıda ve bitki sakaritlerinin ayrılmasının mükemmel çözünürlük sağladığı gösterilmiştir.
Amin değiştirici ve numuneler arasındaki istenmeyen kimyasal reaksiyonlar, deneysel koşullar altında ihmal edilebilir düzeydeydi. Bu kolon üzerindeki genel sakaritlere yönelik k 'değerlerinin, kimyasal olarak bağlı bir amin kolonundan elde edilenlere benzer olduğu gösterilmiştir.
Amin ile modifiye edilmiş silika ile 14 sakaridin ayrılmasının bir örneği gösterilmektedir. Tek tek bileşenler, artan moleküler ağırlığa yaklaşan bir sırada sekiz gruba ayrıldı, oysa iyon değişim kromatografisi kullanılarak kabaca ters sırada sadece 6 grup elde edilebildi.
Yazarlar, iyon değişiminin daha küçük bant genişletme etkileri ile daha fazla hassasiyet sunmasına rağmen, silis sisteminin geniş bir örnek aralığı ile uzun ömür, düşük maliyet ve yüksek çözünürlük sunduğu sonucuna varmışlardır.
Birkaç eksipiyan ve saflık bozucu da eklenebilir. Kapillerlerin kullanıldığı yukarıda belirtilen yöntemin, eroin ve onun temel safsızlıkları ve safsızlıklarının analizi için çok uygun olduğu kanıtlanmıştır.
Amonyum, kalsiyum, potasyum, magnezyum ve sodyum, 4 mM bakır sülfat, 4 mM formik asit ve 3mM 18-taç-6’dan oluşan bir asit Ion Phort BGE’de analiz edildi; asetat, klorür, sitrat, fosfat, sülfat ve tartrat analizi, başka bir tescilli tampon sistemi olan Anitront ve bir Micro-Coatt kapiler yük-tersine çevirme maddesinin kullanılmasını gerektirdi.
Gizli eroin numunelerinde bulunan eroin, ikincil ürünler ve katkı maddelerini hızlı bir şekilde belirleyebilen bir CZE yöntemi, 100 mM potasyum fosfat tamponu pH 3.23.175 içinde 20 mM b-CD kullanılarak açıklanmıştır.Bu koşullar altında, eroin, morfin, 6-monoasetilmorfin (MAM ), asetilkodein, papaverin, kodein ve noskapin başlangıçta 10 dakikadan daha kısa sürede çözüldü. Elde edilen iyi doğrulama sonuçları, ele geçirilen kontrollü ilaç preparatlarının gerçek vakalarına uygulanmasına izin verdi.
Morfin, MAM ve eroinin aynı anda belirlenmesi için çevrimiçi permanganat kemilüminesans (CL) tespiti ile CZE oluşturuldu. B-CD’lerin ayırma verimini iyileştirebileceği ve CL sinyalini artırabileceği bulundu. Bu çalışmada da teyit edildiği üzere, CL, gürültü seviyesini artırmak için nadiren arka plan emisyonu veya saçılımı olduğundan, diğer emisyon prosedürlerinden daha düşük tespit limitleri vermelidir. Ayrıca, az sayıda bileşik kimyasal olarak ışıldadığından, karmaşık matrislerde endojen bileşiklerden minimum etkileşim olmalıdır.
Kumarinler farmakolojik olarak aktiftir ve çok çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmıştır. Kumarin yapılarının büyük çeşitliliği ve geniş kutupsallıkları, eşzamanlı analizleri için özel problemler ortaya çıkarır. Yakın akraba yedi kumarinin CZE ile ayrılması incelenmiştir.
Optimize edilmiş koşullar, 200 mM borik asit 250 mM tetraborat tamponu pH 8.5 ile toplandı ve Chrysanthemum segetum bitkisinden elde edilen köklerden ve havai kısımlardan ekstraktlarda kumarinlerin belirlenmesine uygulandı. Altı kumarinin taban çizgisi ayrılması 10 dakika içinde elde edildi.
Kapiller elektroforez
PAGE elektroforez
Kapiler elektroforez cihazı NEDİR
Kapiller elektroforez cihazı
Elektroforez çeşitleri
Kapiler zon elektroforez
Kapiler elektroforez kullanım alanları
Kapiler elektroforez çalışma prensibi
Sulu Olmayan Kılcal Elektroforez
Sulu olmayan ortamın kullanımı, hidrofobik bileşiklerin analizi için, sulu ortamdaki düşük çözünürlükleri nedeniyle analiz edilmesi genellikle zor olan yeni çekici olanaklar sundu. Sulu tamponlarda elde edilmesi zor olan seçicilikler, sulu çözücülere kıyasla sulu olmayan çözücülerdeki yakından ilişkili iki madde için iyonize edilmiş, iyonize olmayan dengede daha büyük farklılıklar nedeniyle sulu olmayan sistemler kullanılarak kolayca elde edilebilir.
Metanol, ACN, etanol, formamid, dimetil formamid veya çözünmüş tuzlu DMSO gibi organik çözücüler NACE’de BGE olarak kullanılır. Çalışma tamponunda organik çözücülerin kullanılması, düşük akımlar ve düşük joule ısınması ile sonuçlanarak, yüksek elektrik alan kuvvetlerinin kullanımına izin verir.
Üretilen düşük akımlar yalnızca daha yüksek elektrolit tuz konsantrasyonlarının ve daha yüksek elektrik alan kuvvetlerinin kullanılmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda daha geniş iç çapa sahip kapilerler kullanılarak örnek yükü ölçeklendirilebilir ve bu da genel algılama hassasiyetinin artmasına neden olur.
Ancak, kalitatif ve kantitatif ölçümler sırasında numunenin ve elektroforez ortamının buharlaşması ciddiye alınmalıdır. Şimdiye kadar, safsızlık profili için NACE kullanan sınırlı sayıda çalışma bildirilmiştir.
NACE’nin, tetrasiklin hidroklorürü, bilinen dört ve birkaç bilinmeyen safsızlıktan 10 dakika içinde oldukça seçici olarak ayırdığı bulunmuştur. Elde edilen seçicilikler, sulu CE ve LC’de elde edilen seçiciliklerle karşılaştırılabilir veya hatta onlardan daha iyidir. Bilinmeyen safsızlıkları ortaya çıkarmak için LC’ye değerli bir katkı olduğu kanıtlanmıştır.
N-metil formamid içinde 500 mM magnezyum asetat tetrahidrat içeren sulu olmayan bir elektroforez ortamı kullanılarak, OTC ve bununla ilgili maddeler ve bir merhemden tek bir aşamada ekstrakte edilen bozunma ürünleri için seçici ayırma gerçekleştirildi.
Yöntemin, çeşitli ekstraksiyon aşamalarından oluşan sıkıcı bir numune ön işlem prosedürü gerektiren LC ve sulu CE’ye göre avantajlı olduğu bulunmuştur. Sonraki bir çalışmada, OTC ve safsızlıklarından üçünün, tetrasiklin, 4-epiyotetrasiklin ve 4-epitetrasiklin ayrılması, NACE tarafından sağlandı ve katı faz ekstraksiyonu ile domuz plazmasındaki bileşiklerin belirlenmesinde başarıyla uygulandı.
ECD’li NACE’nin safsızlık profili oluşturma potansiyeli, suda çözünürlüğü düşük olan trimetoprimdeki safsızlıkların belirlenmesi ile gösterilmiştir. Farklı miktarlarda bir katışkı ile eklenmiş 2 mM trimetoprim içeren numuneler analiz edildi ve% 0.001 seviyesine kadar tespit limitleri elde edildi.
Simetidinin altı safsızlıktan ve bir bozunma ürününden ayrılması için hem sulu hem de susuz sistemler araştırıldı. Sulu sistemle, iki safsızlık çözünmezdi ve simetidin ve onun safsızlıklarından biri için önemli zirve tortusu gözlemlendi. NACE’nin, hidrofobik safsızlıkları daha iyi pik şekilleriyle ayırmada sulu CE’ye göre faydalı olduğu bulunmuştur; ancak, sekiz bileşenin tümü tek bir deneyde ayrılamadı.
BRL29060 ve BRL57138A, SB202026A ve BRL57259 gibi yapısal olarak benzer bazik bileşikler ve imipramin ve desipramin içeren üç test karışımı, ilk iki test karışımı için çalıştırma tamponu olarak ACN / metanol karışımında sodyum asetat2asetik asit kullanılarak NACE ile kısa bir analiz süresi içinde iyice ayrıldı. ve üçüncü karışım için ACN / metanol karışımı içinde sodyum format2formik asit.
Ayrıca, çalıştırma tamponu olarak ACN / metanol karışımında amonyum asetat kullanan NACE / MS ile analiz edildi ve sonuçlar, tüm bileşenlerin tespiti ile uyumluydu, ancak BRL29060 ve BRL57138A’nın yetersiz ayrılması yoktu. Bu nedenle, veriler niteliksel olarak pik kimliğinin doğrulanması ve yöntem optimizasyonunda pik takibi için kullanılmıştır, ancak MS parametreleri tam olarak optimize edilmediği için niceliksel araç olarak kullanılamaz.
Hidrofobik, yakından ilişkili naftalin sülfonik asitler içeren asidik bir test karışımı için, kısa uçlu enjeksiyon kullanan NACE, ayrılması için uygun bulunmuş ve üç bilinmeyen safsızlık tespit edilmiştir.
Penisilin V ve ilgili maddelerin tayini için hem UV hem de MS tespiti ile 20mM amonyum asetat içeren sulu ve susuz CE sistemleri uygulandığında, NACE bazı avantajlar sunsa da, seçicilik ve duyarlılık açısından en iyi sonuçlar ile elde edilmiştir.
