Doğrudan Kemilüminesans
Akridinyum esterleri, doğrudan antijenlere veya antikorlara eklenebilen ve farklı immünolojik test stratejilerine dahil edilebilen kemilüminesan etiketlerdir. Testin sinyal oluşturma aşamasında, ester bağı, bir ışık parlaması emisyonu ile ayrışan kararsız bileşik N-metil-lakridonu serbest bırakmak için alkali koşullar altında bölünür. Maksimum yoğunluk, başlatmadan 0,4 saniye sonra meydana gelir ve bozunma yarı ömrü 0,9 saniyedir. Bayer ACS1801 ve Centaur1 sistemlerinde kullanılan prensip budur.
Gelişmiş kemilüminesans
Belirli kimyasalların eklenmesi, ışık çıkışını önemli ölçüde artırabilir, örn. yaban turpu peroksidaz, hidrojen peroksit varlığında, ışık emisyonu ile luminolün oksidasyonuna neden olur. İkame edilmiş fenoller ve naftollerin varlığında ışık çıkışı 1000 kattan fazla artar.
Gelişmiş lüminesans, bir ışık parlamasından ziyade bir parıltıdır ve sinyal okuması normalde birkaç dakika sonra gerçekleşse de saatlerce devam eder. Bu tür sinyal üretimi, Vitros ECi1 immünodiagnostik sisteminde (Ortho-Clinical Diagnostics) kullanılır.
Kemilüminesans enzim immünolojik testleri
Yaygın olarak kullanılan enzim etiketlerinin tümü için ışıldayan uç noktalara yol açan substratlar vardır, örn. adamantil 1,2-dioksetan arilfosfat, etiket olarak alkalin fosfataz ile birlikte kullanılır. Fosfat grubunun bölünmesi, ışık emisyonu ile ayrışan kararsız bir anyon üretir, örn. DPC Immulite1 analizöründe kullanıldığı gibi.
Elektrokimyasal Işıldama
Elektrokemilüminesans, kemilüminesans reaksiyonlarını üreten reaktif türlerin bir elektrot yüzeyindeki kararlı öncülerden elektrokimyasal olarak üretilmesiyle geleneksel kemilüminesanstan farklıdır.
Elektrokemilüminesans prosesleri, rutenyum (Ru2+), tris(bipiridil) ve tripropilamin ile oksidasyon-indirgeme tipi reaksiyon dahil olmak üzere birçok farklı mekanizma ile birçok farklı molekül için gösterilmiştir. Bu ilke, Roche Elecsys1 ve E-1701 analizörlerinde kullanılmaktadır.
Bir elektrik potansiyeli uygulandığında, rutenyum etiketi oksitlenir ve aynı zamanda tripropilamin de kendiliğinden bir proton kaybeden kararsız bir katyona oksitlenir.
Ortaya çıkan tripropilamin radikali, oksitlenmiş rutenyum ile reaksiyona girerek, bir foton emisyonu ile bozunan uyarılmış bir rutenyum etiketi üretir. Müteakip ışık emisyonu daha sonra bir fotoçoğaltıcı tarafından ölçülür ve niceleme için uygun şekilde işlenir.
Başlangıç pil potansiyeli
Elektronlar anottan katota mı gider
Galvanik pil ve elektrolitik pil arasındaki farklar nelerdir
Elektrokimyasal piller pdf
Elektrokimyasal piller soru
Pillerde elektrik akım yönü kimya
Pillerde anot ve katot işaretleri
Derişim Pilleri anot katot belirleme
Analitik atomik spektrometri
Analitik atomik spektrometri, vücut sıvıları ve dokularındaki tek tek elementlerin belirlenmesinde yaygın olarak uygulanan bir dizi tekniği içermek için kullanılan bir terimdir.
En önemlileri atomik absorpsiyon spektrometrisi ve atomik emisyon, atomik flüoresans ve X-ışını flüoresans spektrometrisinin de faydalı rollere sahip olduğu endüktif olarak eşleştirilmiş plazma-kütle spektrometrisidir.
Başlıca uygulamalar, temel minerallerin ve eser elementlerin ölçümüne yöneliktir, örn. sodyum, magnezyum, çinko ve bakır ile alüminyum ve kurşun gibi toksik maddeler. Bu teknikler, karmaşık biyolojik numunelerde çok düşük konsantrasyonların doğru ölçümlerini sağlar.
Prensipler
Spektroskopi, madde ve elektromanyetik radyasyon arasındaki etkileşimlerin incelenmesidir; nicel analize uygulandığında, spektrometri terimi kullanılır.
Farklı spektroskopi türleri, elektromanyetik spektrumun çeşitli bölgeleri (örneğin X-ışınları, UV ışığı, kızılötesi radyasyon), etkileşimlerin meydana geldiği maddenin özellikleri (örneğin moleküler titreşim, elektron geçişleri) ve ilgili fiziksel etkileşimler ile ilgilidir. (yani saçılma, radyasyon emilimi veya emisyonu).
Kantitatif analitik atomik spektrometrik teknikler arasında atomik absorpsiyon (AAS), atomik emisyon (AES), atomik floresan (AFS), inorganik kütle spektrometrisi ve X-ışını floresansı (XRF) bulunur. AAS, AES ve AFS, UV ve görünür ışık ile serbest, gazlı, yüksüz atomların dış kabuk elektronları arasındaki etkileşimlerden yararlanır.
XRF'de, yüksek enerjili parçacıklar, X-ışını fotonlarının emisyonuyla sonuçlanan geçişleri başlatmak için atomların iç kabuk elektronlarıyla çarpışır. İnorganik MS için, bir manyetik alan iyonize analit atomlarını kütlelerine göre ayırır: yük oranı.
Atomik emisyon, absorpsiyon ve floresan
Her element, nötrlüğü sağlamak için gerekli elektron sayısıyla çevrili pozitif yüklü bir çekirdeğe sahip karakteristik bir atomik yapıya sahiptir. Bu elektronlar ayrı enerji seviyelerinde yer alırlar, ancak bir elektronun atom içinde bir seviyeden diğerine hareket etmesi enerjinin eklenmesiyle mümkündür.
Bu enerji, diğer atomlarla veya serbest elektronlarla çarpışmalarla veya ışıktan fotonlar olarak sağlanabilir. Bu tür geçişler, ancak mevcut enerji iki seviye arasındaki farka eşitse (E) meydana gelecektir.
Yüksüz atomlar, kaç elektronun daha yüksek enerji seviyelerine taşındığına bağlı olarak en düşük enerji seviyesinde veya temel halde veya bir dizi uyarılmış durumdan herhangi birinde bulunabilir, ancak sadece ilk geçişi düşünmek olağandır. Enerji seviyeleri ve elektron geçişleriyle ilişkili Es, her element için benzersizdir.
Çoğu elementte dış kabuk elektronlarının hareketleri için E, UV-görünür radyasyona eşdeğer enerjiye karşılık gelir ve AA, AE ve AF spektrometrisi için kullanılan bu geçişlerdir. Bir fotonun enerjisi ðEÞ ile karakterize edilir:
E 1⁄4 h)
burada h 1⁄4 Planck sabiti ve ) 1⁄4 o fotona karşılık gelen dalga biçiminin frekansı (dalga biçimi ve ayrı parçacıklar olarak ışığın ikili kavramı burada daha fazla dikkate alınmaz). Ayrıca, frekans ve dalga boyu şu şekilde ilişkilidir:
1⁄4 c!
ve bundan özel bir geçişin, E'nin benzersiz bir dalga boyu ile ilişkili olduğu sonucu çıkar.
Uygun koşullar altında, analitik sistem içindeki buharlaşmış, temel durumdaki atomların dış kabuk elektronları termal enerjiyle (yani diğer atomlarla çarpışmalar) uyarılabilir.
Bu atomlar daha kararlı temel duruma döndükçe, bir kısmı bir dedektörle ölçülebilen yayılan ışık şeklinde olacak olan enerji kaybolur. Bu ışığın yoğunluğu, mevcut atomların sayısı ile orantılıdır ve süreç, atomik emisyon spektrometrisidir (AES).
Karakteristik bir dalga boyundaki ışık (ışıma enerjisi) bir analitik sisteme girdiğinde, enerji emildikçe ışık yolundaki karşılık gelen atomların dış kabuk elektronları uyarılacaktır. Sonuç olarak, bir kaynaktan dedektöre sistem aracılığıyla iletilen ışık miktarı azaltılacaktır.
Işık kaybı, atom sayısıyla orantılıdır ve atomik absorpsiyon spektrometrisi (AAS) olarak anlaşılır. Temel durumdaki atomlar tarafından emilen ışıma enerjisinin bir kısmı, atom temel duruma dönerken ışık olarak yayılabilir.
Bu emisyon rezonans floresansı olarak tanımlanır ve yine yoğunluğu ışık yolundaki atomların sayısı ile orantılıdır. Teknik, atomik floresan spektrometrisi olarak bilinir.
Protein Mühendisliği
Genetik mühendisliğindeki son gelişmeler, saflaştırmayı kolaylaştırmak için proteinlerin yapısını değiştirme olasılığını yaratmıştır. Spesifik bir proteini kodlayan genlerin manipüle edilmesiyle, füzyon peptidleri, saflaştırılmalarına yardımcı olan N ve C terminallerine eklenebilir.
Peptit uzantıları daha sonra çıkarılır ve protein, geleneksel saflaştırma yöntemleriyle geri kazanılır (Shine ve diğerleri, 1980). Belirli bir yöntem, bir dizi arginin kalıntısının eklenmesiyle izoelektrik noktayı büyük ölçüde değiştirmek için proteinin C-terminalini kullanır.
Ligandları N-terminaline bağlayan diğer birçok “saflaştırma füzyonunun” aksine, bu, proteinin doğru şekilde katlanmasına izin verir. Katyon değişim kromatografisi ile ilk saflaştırmadan sonra, arginin kalıntıları bir ekzopeptidaz (karboksipeptidaz B) ile uzaklaştırılabilir, böylece ilgilenilen proteinin pl’si değiştirilir ve daha sonra ikinci bir katyon değişim aşaması çıkarılır.
Protein, bu ikinci aşamada farklı bir pozisyonda ayrıştırılırken, kirleticiler değişmeden kalacaktır (C-terminalinde bir dizi arginin kalıntısına sahip olmadıkları sürece).
Bu metodoloji, proteinleri önceden planlanmış saflaştırma prosedürlerine uyacak şekilde tasarlama heyecanını sunar. Belki gelecekte tüm proteinler için tek bir işlem kullanmak mümkün olabilir (birincil dizinin önceden bilinmesi şartıyla).
Aşağıdaki bölümler, HPLC’nin proteinlerin, peptitlerin ve amino asitlerin izolasyonunda ve analizinde kullanılan çeşitli yöntemlere uygulanmasını tartışmaktadır. Gözetimsiz gradyan geliştirmeye izin veren enstrümantasyonla birleştirilmiş yeni sabit fazların geliştirilmesi, saflaştırma görevini dönüştürmüştür. Bu yönlerden bazıları da bu bölümde tartışılacaktır.
İyon Değiştirici Kromatografi
İyon değişim kromatografisi (IEC), proteinlerin ayrılması için en yaygın kullanılan moddur, çünkü optimum kromatografik koşullar, karmaşık biyopolimerlerin ikincil ve üçüncül yapısının korunması ile uyumludur.
IEC’de bir çözünen maddenin tutulması iyonik kuvvet, pH ve sıcaklık değiştirilerek kontrol edilebilir. Ek olarak, bu parametrelerin iyileşmeyi de etkileyebileceği gözlemlenmiştir.
Bununla birlikte, mobil faz seçimi çoğu protein için ampiriktir ve bir saatten daha kısa çalışma süreleri (yeniden dengeleme dahil) kullanarak kromatografik koşullar geliştirme yeteneği bu nedenle oldukça faydalıdır. Silika veya organik polimere dayalı yüksek performanslı anyon ve katyon değiştiriciler artık yaygın olarak kullanılmaktadır ve önceki sabit faz türlerinde bulunmayan bir kararlılık derecesine sahiptirler.
IEC proteinleri için kullanılan sabit fazlar, büyük bir gözenek boyutuna (30-50 nm) sahip olan küresel boncuklardan oluşur. Büyük gözenek boyutu mekanik mukavemeti azaltır ve bu nedenle daha düşük çalışma basınçları gerekir (tipik olarak 1 ml / dakikada 500 psi’den büyük değildir).
IEC proteinleri için en popüler ve başarılı sabit faz türleri, Toyo Soda’dan polimer bazlı TSK-PW, Pharmacia’dan FPLC Mono Beads ve Synchrom Inc.’den silika bazlı Synchrom boncuklarıdır.
Polimer bazlı sabit fazlar, yüksek pH değerlerinde (> pH 8.0) silika ile ilişkili çözünme problemlerinden muzdarip olmadıklarından daha geniş bir pH aralığında (pH 2.0-pH 10.0) kullanılabilir.
Bu durağan aşamalar bu nedenle daha popülerdir. Yeni TSK-5PW-SP sabit fazdaki (500 ml yatak hacmi) hazırlayıcı ayırmalar, analitik boyutlu bir kolon üzerinde elde edilenlerle karşılaştırılabilir sonuçlar vermiştir (Brewer ve diğerleri, 1986), böylece gram miktarlarının hazırlanması için ölçek büyütmeye izin verir.
Katyon değişimi kullanılarak doku kültüründen insan gama interferonunun saflaştırılmasında bir ara aşama gösterilmektedir. 10 mM sodyum fosfat, pH 7.0 içinde dengelenmiş bir Mono-S sabit faz, dengeleme tamponunda% 20 etilen glikol ile kullanıldı. Elüsyon, gösterildiği gibi doğrusal bir tuz konsantrasyonu ile gerçekleştirildi.
Jel filtrasyon kromatografisi nedir
Afinite kromatografisi nedir
Adsorpsiyon kromatografisi Nedir
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Kolon kromatografisi nedir
İyon değişim kromatografisi nedir
İyon exchange kromatografisi
İyon kromatografisi nedir
Ters Faz Kromatografisi
Büyük proteinlerin (> 30 kDa) kromatografisi için geniş gözenekli yüksek performanslı ters faz desteklerinin getirilmesi, bu sabit fazların her boyuttaki proteinler için kullanılmasını teşvik etmiştir.
Teoride, geniş gözenekli sabit fazlar, yalnızca moleküller daha küçük gözeneklere girmekten dışlanacak kadar büyük olduğunda gereklidir. Genel olarak, daha küçük gözenek boyutlu sabit fazların kullanılması yararlıdır çünkü bunlar, bağlanma için mevcut yüzey alanındaki artıştan dolayı daha büyük bir verime sahiptirler.
Böylece, küçük bir protein için, daha küçük gözenek boyutlu sabit fazda daha yüksek bir plaka numarası (N) elde edilecektir. Birçok biyolojik olarak aktif protein, organik çözücüler tarafından veya ters fazın normal olarak çalıştığı düşük pH ile denatüre edilebilmesine rağmen, diğer proteinlerin, mobil fazın çıkarılması üzerine yeniden katlanma yeteneklerinden dolayı oldukça stabil olduğu bulunmuştur.
Belirli durumlarda, özellikle protein sekans analizi için saflaştırılıyorsa, biyolojik aktivitenin sürdürülmesi gerekli olmayabilir.
Ters fazlı bir protein ayırma örneği, gösterilmektedir, burada Tip I ve I11 kolajenin (300 kDa) olgun formlarının, geniş gözenekli bir deri üzerinde 30 dakikadan daha kısa bir sürede tamamıyla ayrılması sağlanmıştır. Asetonitrilin trifloroasetikasidin bir aşamalı gradyanı kullanılarak Cı sabit faz. Kromatografiden 30 dakika önce 56 ° C’de denatürasyon, ayrı alt birim zincirlerinin çözülmesine izin verdi.
In vivo alt nanomol miktarlarında bulunmalarına rağmen ters faz kromatografisi kullanılarak başarıyla izole edilmiş proteinlerin uzun bir listesi vardır. Bunlar, kolajen, kan proteinleri, enzimler, hormonlar, glikoproteinler gibi yapısal proteinleri ve insan büyüme hormonu ve epidermal büyüme faktörü gibi farmasötik açıdan ilginç proteinleri içerir.
Ek olarak, proteinlerdeki konformasyonel değişiklikleri incelemek, protein hidrolizatlarında sistein içeren peptitleri tanımlamak ve küçük ve büyük moleküller arasındaki kromatografik davranış farklılıklarını incelemek için ters faz kromatografisi kullanılmıştır.
Ters fazlı kromatografide proteinlerin tutulma mekanizması açıkça tanımlanmamıştır, ancak çözünürlük kaybı olmadan daha kısa kolonlar kullanma yeteneği, işlemin tek başına basit bölme kromatografisi ile kontrol edilmediğini göstermektedir.
Bu nedenle, kolon verimliliğini değerlendirirken, basit organik moleküller yerine bir dizi hidrofobikliğe sahip bir protein karışımından oluşan bir standardın kullanılması önemlidir. Ek olarak, bu, kısa kolonlu sistemlerin, maliyette önemli bir tasarruf sağlayacakları için protein ayırmaları için en uygun olabileceği anlamına gelir.