Boyut Dışlama Kromatografisi
Mod, sabit fazdaki gözeneklerin farklı moleküler boyutlara sahip moleküllere erişilebilirliğine dayanır ve proteinler, karbonhidratlar ve lipidler gibi yüksek molekül ağırlıklı biyolojik örnekler için özel bir uygulamaya sahiptir. Daha küçük bileşenler gözeneklere daha fazla nüfuz edebilir ve bu nedenle gözeneklerden hariç tutulan daha büyük moleküllere göre kolon üzerinde daha uzun süre tutulur.
Adsorpsiyon Kromatografisi
Bu modda, silika (veya bazen alümina) genellikle sabit faz olarak kullanılır, ancak bu yöntem biyolojik numuneler için yaygın olarak kullanılmaz ve genellikle bağlı normal faz sabit fazlarla değiştirilir. Yöntem, mobil faz ve sabit faz için numunenin farklı afinitelerine dayanır.
Bölme Kromatografisi
Tüm uygulamaların% 90’a kadarı, iki karışmayan sıvı faz arasında çözünen maddelerin bölünmesine dayanan bu kromatografi modunu kullanır; biri sağlam bir desteğe, diğeri mobil. En popüler sabit faz, oktadesilsilan (OD’ler veya C ,,) kaplı silika partikülüdür, ancak daha düşük homologlar (Cı, C,) de kullanılır.
Ters faz kromatografisinin popülaritesi, zincir uzunluğu, zincir tipi ve karbon yüklemesi bakımından değişen çok sayıda ticari ambalajın mevcudiyeti ile artmaktadır. Bu nedenle, kromatograf sadece hareketli faz bileşimini değiştirerek değişen seçicilik seçimine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda farklı bir sabit fazı da seçer.
Kromatografiyi fazlamak mümkündür. İyonik yükler, tersine çevrilmiş pH kullanılarak hem iyonize edilmiş hem de iyonize edilmemiş ayrı çözünen maddelerin manipülasyonu veya bir iyon çifti reaktifinin dahil edilmesiyle bastırılabilir.
Daha polar bileşenler için, bağlı normal faz destekleri özellikle yararlıdır ve çözücü bileşimi değişikliklerine hızlı bir tepkiye izin vererek silika üzerinde adsorpsiyon kromatografisine göre faydalara sahiptir.
Ligand değişimi ve afinite kromatografisi gibi diğer bölme kromatografisi modları, suda çözünür biyomoleküllerin çözülmesi için özel uygulamalar bulmuştur.
Afinite kromatografisi
Jel Filtrasyon kromatografisi
İyon değişim kromatografisi
İyon exchange kromatografisi
Adsorpsiyon kromatografisi
Afinite kromatografisi çalışma prensibi
Hidrofobik etkileşim kromatografisi
İyon Kromatografisi
İyon Değişim Kromatografisi
İyon değişim kromatografisinde tutulma, çözünen maddenin karşıt yüklü grupları ile sabit faz arasındaki elektrostatik etkileşimler tarafından yönetilir. Seçicilik, mobil fazın doğasından veya sıcaklıktan etkilenebilir.
Özellikle çok bileşenli örnekler için belirli uygulamalar, bileşenleri yeterince ayırmak için birden fazla HPLC modu gerektirir ve bu, çok boyutlu HPLC kullanılarak sağlanabilir.
Çözücü Seçimi
Bu bölüm, ilk ilkelerden mobil faz seçimine rehberlik etmek için tasarlanmıştır. Mobil faz bileşiminin seçimi, elde edilebilen büyük ölçüde farklı seçicilikler nedeniyle kritiktir. Bazı durumlarda, son seçimi, kullanılabilirlik ve gider gibi önemsiz faktörler belirleyebilir.
Uygun bir mobil fazın seçimi için esasen üç kriter vardır. Bunlar numunenin fizikokimyasal özelliklerine, çözücülerin fizikokimyasal özelliklerine ve örneğin TLC ile hareketliliğine (mümkünse) dayanmaktadır.
Numunenin Fizikokimyasal Özellikleri
Numune kolona ayırma için kullanılandan farklı bir çözücü içinde uygulanırsa olağandışı kromatografik etkiler gözlemlenebilir.
Örneğin, numune daha güçlü bir çözücü içinde çözülürse, o zaman sütun dengesinin bozulduğu bir bant, sütunda aşağı doğru ilerler ve çoğu zaman çözünürlüğü bozar. Bu nedenle, genel bir kural olarak, numunenin çözünür olduğu bir mobil faz seçmek ve çözünürlük sınırlayıcı bir faktör ise daha büyük bir enjeksiyon hacmi kullanmak her zaman en iyisidir.
Çözücülerin Fizikokimyasal Özellikleri
Çeşitli çözücülerin genel fizikokimyasal özelliklerini göstermektedir. Teoride, bu çözücülerden herhangi biri kromatografi için kullanılabilir, ancak pratik amaçlar için bir dizi çözücü genellikle çeşitli nedenlerle ortadan kaldırılabilir:
(a) yüksek viskoziteye sahip çözücüler, kromatografik kolondaki akış sırasında daha yüksek geri basınçlara neden olur,
(b) düşük kaynama noktalarına sahip çözücülerin hareketli fazda sabit bir konsantrasyonda tutulması zor olabilir ve ayrıca yangın tehlikesi oluşturabilir,
(c) yüksek UV kesme dalga boyuna sahip çözücüler, yaygın olarak kullanılan dalga boyu aralıklarında UV tespitini engeller,
(d) bazı çözücüler toksiktir (örneğin benzen) ve
(e) bazı çözücülerin saflığı partiden partiye değişebilir.
Bu nedenle, yalnızca sınırlı sayıda çözücü genel kullanıma sahiptir. Asetik asit ve trietilamin, bazen iyon değişim kromatografisinde kullanılan sulu tamponların hazırlanmasında kullanıldıkları için dahil edilmiştir.
Son olarak, esas olarak tutulmayı kontrol eden çözücü mukavemeti olsa da, protik çözücülerdeki hidrojen bağının da tutmayı etkileyebileceğine dikkat edilmelidir.
Numunenin TLC’ye Göre Hareketliliği
Çoğunlukla tek bir çözücü, optimum kromatografik çözülmeye izin vermez ve ayırmaların çoğu, mobil faz olarak çözücülerin bir karışımını kullanır. Optimum mobil faz seçimi genellikle deneme yanılma yoluyla belirlenebilir, ancak TLC kullanılarak bazı kılavuz bilgiler de elde edilebilir.
Teorik olarak, bir TLC plakasındaki mobilite, k ‘= (1 – Rf) / Rf olduğundan, HPLC tutulmasıyla doğrudan ilişkilidir, ancak, TLC dengesiz bir işlem olduğundan ve genellikle daha düşük çözücü kuvvetleri gerektiğinden pratikte farklılıklar vardır. eşdeğer bir HPLC ayırması için. Bununla birlikte, TLC hareketliliği, birçok çözücü karışımını karşılaştırmak için hızlı bir yöntem de sağlar.
Genel olarak, bir numune karışımının ayrıştırılmasının geliştirilmesinde, numune başlangıçta düşük elüsyon kuvvetine sahip bir çözücü içinde HPLC kolonuna enjekte edilir ve daha sonra ilgili bileşikler kolondan ayrılıncaya kadar sürekli olarak da arttırılır.
Bu yöntemin temel sınırlaması, elüsyonun gerçekleştirilmesinin uzun zaman alabilmesi ve sonuç olarak, bu prosedürü, eluent kuvvetinde farklı sıçramalar ile tersine kullanmanın genellikle daha hızlı olmasıdır. Modern ekipman, gradyan geliştirmenin gözetimsiz yürütülmesine izin verir.
Birçok üretici, korozyon olasılığı nedeniyle paslanmaz çelik pompalarda düşük pH değerinde halojenür iyonlarının kullanımından kaçınılmasını önermektedir. Bu nedenle, halojenür iyonlarının kullanıldığı yerlerde, kullanılmadığında sistemden su ile yıkanmaları da tavsiye edilir.
Halide iyonları kullanılırken, pompanın haftada en az bir kez 20 dakika süreyle sistemden (kolondan değil!)% 20 nitrik asit solüsyonu pompalanarak da geçirilmesi tavsiye edilir.