İsoelektrik Noktasının Belirlenmesi – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi – FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
KAPILLAR BÖLGE ELEKTROFOREZ
CZE’de proteinler, elektroforetik hareketliliklerindeki farklılıklara göre birbirinden ayrılır. Elektroforetik hareketlilik, bir proteinin moleküler yükünün ve hidrodinamik boyutunun bir fonksiyonudur. Belirli bir ortamda, elektroforetik hareketlilik, izoelektrik noktaya benzer şekilde proteinin kendine özgü bir özelliğidir.
Bu nedenle hareketlilik, proteinleri birbirinden ayırmak için kullanılabilir. Bu, nihai ürün ve ambalaj etiketlemesi için basit bir kimlik testi olarak CZE’yi kullanmanın temelidir. Örnek olarak, altı rMAb, bir rFab ve bir rF (abu) 2’nin CZE profilleri Şekil 9’da gösterilmektedir. Burada kullanılan proteinler, 7.5 ila 9.3 arasında değişen pI değerleri açısından benzerdir.
Ek olarak, rMAb’ler arasındaki amino asit sekansı homolojisi, rMAb 5 ve rMAb 5u arasında% 99 homoloji ile% 90’dan fazladır. Bu terapötik proteinlerin profilleri, protein yükü varyantları ile ilgili birçok pikin, bir genel koşul altında 15 dakikadan daha kısa bir sürede çözüldüğünü gösterir. Her molekül için ana pikin göç zamanlarının birbirinden açıkça farklı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ma ve Mire-Sluis’in belirttiği gibi, 40 bu benzersiz geçiş süresi, bir kimlik testi için gereken özgüllüğü sağlar.
CZE’nin yük heterojenliğini izleme potansiyeli, rMAb numunelerinin profillerinde gözlenen çeşitli zirvelerin daha fazla araştırılmasıyla incelenmiştir. RMAb 1 elektroferogramının genişletilmiş bir görünümü Şekil 10A’da gösterilmektedir. Karboksipeptidaz B sindirimi ile tedavi, üç ana zirvenin, ağır zincir üzerinde sıfır, bir ve iki C-terminal lizin41 kalıntısına sahip antikor formlarına karşılık geldiğini doğruladı.
Kullanılan CZE koşulları altında, antikor pozitif olarak yüklenir ve detektörü geçen katoda doğru hareket eder. Antikorun 2-Lys formu en yüksek sayıda net pozitif yüke sahiptir ve bu nedenle yüksek elektroforetik hareketliliği nedeniyle en hızlı şekilde yer değiştirir. Sonuç olarak, antikorun 1-Lys ve 0-Lys formları, azalan hareketlilik sırasına göre yer değiştirir. Ek olarak, daha düşük elektroforetik hareketliliğe sahip antikorun asidik varyantlarının 0-Lys zirvesinden sonra göç ettiği gözlendi.
CZE, yük heterojenliğinin analizi için potansiyel bir tamamlayıcı araç olarak yaygın olarak kullanılan iyon değişim kromatografisi (IEC) tekniği ile karşılaştırılır. RMAb 1’in IEC analizinden elde edilen tipik bir kromatogram Şekil 10B’de gösterilmektedir. CZE’ye benzer şekilde, üç ana tür, ağır zincirde sıfır, bir ve iki C-terminal tortusu olan antikor formlarıydı. Bu durumda, elüsyon sırası, ilk olarak 0-Lys türlerinin ayrıştırıldığı CZE’dekine zıttı çünkü bu üç form arasında en asidik türdü; bu nedenle, katyon değişim kolonunun negatif yüzeyi ile en zayıf etkileşime sahipti.
Asidik varyantlar, 0-Lys pikinden önce yıkanarak da gözlendi. Rekombinant antikorların yük heterojenliğini izlemek için CZE yönteminin avantajları, hızlı analiz sürelerinde birden fazla ürünü analiz etmek için bir jenerik CZE koşulunu kullanma olasılığını içerir. Bu, hücre kültürü sırasında üretilen rMAb numunelerinin yüksek verimli analizini ve proses geliştirmenin saflaştırma çabalarını karşılamak için önemli bir özelliktir.
CZE, terapötik rMAb’lerin formülasyon geliştirilmesinde ve stabilitesinin izlenmesinde pratik bir teknik olarak da kullanılabilir. Tahlilin, çeşitli zorunlu bozunma koşullarına maruz kalan rMAb numunelerindeki değişiklikleri tespit etme yeteneği değerlendirildi. Çeşitli koşullar altında zorla bozulmuş örneklerin temsili CZE profilleri Şekil 11’de gösterilmektedir. Bu sonuçlar, testin bir kontrol rMAb örneğinin yük heterojenliği profilindeki değişiklikleri saptayabildiğini gösterdi.
Amino asitlerde izoelektrik nokta nedir
Glisin titrasyon eğrisi
Biüret deneyi raporu
İzoelektrik nokta hesaplama
Biüret Deneyi prensibi
Ksantoprotein deneyi
Ninhidrin reaksiyonu
Amino asitlerin titrasyon eğrisi
KAPILLAR ISOELEKTRİK ODAKLAMA
Terapötik proteinlerin proses gelişimi ve analitik karakterizasyonu, bu biyoteknoloji ürünleriyle ilişkili karmaşıklık ve heterojenlik nedeniyle birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Daha önce, terapötik rMAb’ler kalitatif, emek yoğun jel IEF yöntemleri kullanılarak karakterize ediliyordu. Kapiler izoelektrik odaklama (cIEF), geleneksel jel IEF’in yüksek çözme gücünü CE enstrümantasyonunun avantajı ile birleştirir.
Proteinler, kılcal damarlara bir elektrik alanı uygulandığında taşıyıcı amfoliitler tarafından oluşturulan bir pH gradyanında izoelektrik noktalarına (pI) göre ayrılır. Bir proteinin pl’si (proteinin net sıfır yüke sahip olduğu pH), amino asit bileşimi, dizisi, 3-D yapısı, çeviri sonrası modifikasyonları vb. İle tanımlanır.
CIEF’te genellikle LIF ve UV gibi çevrimiçi konsantrasyona duyarlı dedektörler kullanılır. Çoğu ticari CE cihazındaki dedektör, kılcalın çıkışına doğru sabit bir noktadadır. Sonuç olarak, kılcal damar içindeki odaklanmış protein bölgeleri, detektör penceresinden geçmek için harekete geçirilmelidir.
İsoelektrik Noktasının Belirlenmesi
CIEF’in önemli bir uygulaması, bir proteinin izoelektrik noktasının belirlenmesidir. Klasik IEF’de olduğu gibi, cIEF yöntemi, pI’leri bilinen standart işaretleyicilerle kalibrasyonu içerir. CIEF’de yaygın olarak kullanılan belirteçler, geleneksel protein standartlarına kıyasla büyük stabilite ve algılama hassasiyeti olan sentetik düşük moleküler ağırlıklı bileşiklerdir.
Bilinmeyen izoelektrik noktası ve pl markörleri olan bir rMAb’nin tipik cIEF profilleri Şekil 12’de gösterilmektedir. Ağır zincirlerin karboksil terminalinde sıfır, bir ve iki lizin kalıntısına sahip üç antikor formunu temsil eden üç ana tepe gözlendi.
PI’ye karşı mobilizasyon süresinin bir grafiği, tanımlanmış bir pH aralığında doğrusallık göstermelidir. Böyle bir kalibrasyon grafiği Şekil 13’te gösterilmektedir ve görünen pl değerleri, pI’lerinin belirlenmesi için sırasıyla 0-Lys, 1-Lys ve 2-Lys antikor formları için 9.0, 9.1 ve 9.2 olarak hesaplanmıştır. bir rMAb’nin bileşenleri.
RMAb Şarj Heterojenliğinin İzlenmesi
CIEF’in genel rMAb yük dağılımını değerlendirme potansiyeli Şekil 13’te gösterilmektedir. Elektroferogram, pI markörleri 7.9 ve 5.3 arasındaki antikorun çeşitli izoformlarını gösterir. Antikorun ana zirvesi veya 0-Lys formu B27 dakikada görünür. Ağır zincirde bir ve iki C-terminal Lys kalıntısına sahip daha temel türler, birbirlerinden ve ana pikten temelde ayrıştırılır.
Sonuçları, Şekil 10’da gösterildiği gibi CZE ve IEC tarafından elde edilenlere benzerdir. Öte yandan, asidik varyantlar, Şekil 13’te gösterildiği gibi, cIEF tarafından 0-Lys formundan daha iyi ayrılır. Şekil 10. Birlikte ele alındığında bu veriler, terapötik proteinlerin yük heterojenliğini izlemek için IEC ile tamamlayıcı bir teknik olarak cIEF’i kullanmanın uygulanabilirliğini gösterir.
Amino asitlerde izoelektrik nokta nedir Amino asitlerin titrasyon eğrisi Biüret Deneyi prensibi Biüret deneyi raporu Glisin titrasyon eğrisi İzoelektrik nokta hesaplama Ksantoprotein deneyi Ninhidrin reaksiyonu