HPLC Ayrımı – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Yapı, çok benzer bir yapıya sahip bileşiklerin (örneğin, geometrik ve optik izomerler) ayrılmasına izin vererek, stereospesifiklik özelliğini verir. Bu kromatografik modda, tutulmayı etkileyen faktörler, iyon değişim kromatografisindekilerden oldukça farklıdır ve bu, dengeleme tamponunda kullanılan yüksek tuz konsantrasyonunda yansıtılır. Kromatografik süreç aşağıdaki gibi gösterilebilir.
Durağan faz başlangıçta protonlanmış form (SH +) olarak dengelenir, proton daha sonra metal iyonu (M) ile yer değiştirir ve ardından bağlantı koordine edilir (SMLt). Elüsyon, asitleştirme veya rakip bir bağ (gösterilmemiştir) ilavesiyle elde edilir, ancak ikincisi metal iyonunu çıkarmaz.
Sabit Faz Özellikleri
Metal şelat kromatografisi, başlangıçta agaroz ve polistiren divinilbenzen gibi düşük basınçlı sabit fazlar kullanılarak geliştirilmiştir. Silika mikro kürelerin eklenmesi, daha hızlı akış hızlarının kullanılmasına izin vermiş ve verimliliği artırmıştır.
Silikaya bağlı metal iyon komplekslerinin bazı örnekleri Şekil 9.5’te gösterilmektedir. HPLEC’de kullanılan popüler bir kiral ligand, amino asit prolindir. Alternatif olarak, bir iyon değişimli sabit fazda D, L-amino asitleri ayırmak için mobil faza bir prolin-bakır kompleksinin eklenmesi kullanıldı.
Hem küçük kiral moleküller hem de daha büyük biyopolimerler (LKB Enantiopak) içeren HPLEC sabit fazları ticari olarak mevcuttur. İkinci sabit faz kullanılarak ayrılan bileşiklerin bir listesi gösterilmektedir.
HPLEC sabit fazlarının hazırlanmasında kullanılan yöntemler, yumuşak jel matrisleri için geliştirilenlere benzer: kontrollü gözenekli camı 3- (2-aminoetil-1amino) propil-trimetoksisilan ile işleme tabi tutarak ve ardından kolonu perfüze ederek Bakır sülfatlı kolon, bir bakır şelat desteği hazırlanır.
Silikanın bakır sülfat ile doğrudan işlenmesi de kullanılabilir. Bu durağan fazların hazırlanmasında kullanılan yöntemler literatürde bulunabilir.
yüksek performanslı sıvı kromatografisi (hplc)
HPLC pik yorumlama
HPLC kolon seçimi
HPLC PDF
HPLC çalışma prensibi
HPLC ile yapılan Analizler
Hplc Nedir
HPLC sonuç değerlendirme
Mobil Faz Efektleri
Amino asitler ve dansil amino asitlerin ayrılması için mobil faz kiral katkı maddelerinin kullanımı daha önce gözden geçirilmiştir. Çoğu ayırma, metal olarak bakır (I1) ile N, N-di-n-propil-1-alanin gibi bir ligand kullanılarak ters faz modunda gerçekleştirilmiştir.
Başlangıçta çözülmeyen türler, mobil faz koşullarının değiştirilmesiyle ayrılabilir. Koordinasyon kompleksinin oluşumu dipol etkileşimlerine bağlı olduğundan, pH, iyonik kuvvet, sıcaklık gibi mobil faz parametrelerinin değiştirilmesi ve ayrıca metal iyonunun tipi tutmayı etkileyecektir. HPLEC’de kullanılan en yaygın metal iyonları şunlardır: Zn (II), Cu (II), Ni (II), Co (II), Hg (I1) ve Cd (I1).
Hareketsizleştirilmiş nikel iminodiasetat üzerinde amino asitlerin tutulmasına ilişkin bir çalışmada, hem amino asitlerin hem de metal iyonunun koordine edildiği sabit fazın iyonizasyonu nedeniyle pH değişiminin farklı amino asitler üzerinde farklı bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur.
Histidin ve sistein kalıntıları, nötr pH’ta Zn (I1) ve Cu (I1) ile stabil kompleksler oluşturacaktır ve bu nedenle, peptitleri veya proteinleri ayırırken kritik kalıntılardır.
Özet
Hem HPLAC hem de HPLEC, kromatografi alanına yeni girişlerdir ve şu anda ticari olarak temin edilebilen sabit fazların nispeten azı yaygın olarak kullanılmaktadır. HPLEC tarafından yapılan en önemli katkı, optik izomerlerin saflaştırılmasının basitleştirilmesi ve diğer geometrik izomerlerin ayrıştırılmasındaki potansiyel kullanımıdır.
Pratik Yönler
Bu bölümün amacı, başarılı ve tekrarlanabilir ayırmalar için hayati önem taşıyan daha genel hususları kromatografi uzmanına tanıtmak veya hatırlatmaktır. Bunu yaparken, bölüm hem acemilere hem de daha deneyimli kromatograflara fayda sağlayacak bir dizi kromatografik ipucu ve püf noktası içerir. Kromatografik sistem bir bütün olarak tartışılacak ve daha sonra tek tek bileşenler incelenecektir.
Genel Operasyon
Başlangıçta solvent rezervuarları, önerilen kromatografik ayırma için yeterli mobil faz içerdiklerinden emin olmak ve böylece pompalara hava çekilmesini önlemek için kontrol edilmelidir. Mobil faz daha sonra dedektörden sabit bir taban çizgisi sinyali elde edilene kadar kolon boyunca pompalanabilir.
Bu genellikle 4,6 mm I.D için 0,5 ile 4 ml / dakika arasında bir akış hızı gerektirir. 5 ila 60 dakika arasındaki herhangi bir şey için sütun. Geri döndürülemez hasara neden olabileceğinden, sütun geri basıncının sütun için önerilen sınırlamaları aşmamasına dikkat edilmelidir.
Daha sonra, sistemin düzgün çalıştığından ve belirli uygulama için yeterli seçicilik, çözünürlük ve tutmanın elde edildiğinden emin olmak için bir test numunesi enjekte edilmelidir. Kolona yüklenen bileşenlerin her birinin daha sonra kolondan ayrıştırılmasının sağlanması önemlidir.
Bu, ya numune bileşimi bilgisi ile ya da güçlü bir şekilde bağlanmış herhangi bir malzemeyi uzaklaştırmak için çok daha güçlü bir mobil faz ile sütunun yıkanması ile elde edilir. Mobil fazın kolonla uyumlu olmasını sağlamak için her zaman özen gösterilmelidir.
Bileşenlerin kolon üzerinde kalması durumunda, bunlar daha sonra yavaşça sızarak takip eden kromatografik çalışmada anormal zirvelere veya aşırı temel gürültüye neden olabilir. Ek olarak, kirlilikler kolon üzerinde birikerek kolon verimliliğinde bir azalmaya neden olabilir. Kromatografi, tatmin edici kromatogramlar elde edilene kadar alternatif mobil fazlarla tekrar edilebilir.
Bir HPLC Ayrımının Oluşturulması
Başarılı bir HPLC analizinin kurulduğu yöntem, büyük ölçüde numune bileşimi hakkında bilinenler tarafından belirlenir. Örneğin, belirli bir tipteki bilinen bileşikler için okuyucunun, daha önce hangi sistemlerin açıklandığını belirlemek için bu kitapta yer alan uygulama bölümlerine başvurması tavsiye edilir. Alternatif olarak, bilinmeyen bir bileşik veya kitabında açıklanmayan bir bileşik için, okuyucu bu bölümde ve Bölüm 2’de ana hatları verilen ilk ilkelere dayalı olarak bir ayrım oluşturabilecektir.
Mod Seçimi
Belirli bir örnek için, en uygun durağan fazın seçimine izin vermek için çok az bilgi gereklidir. Mod seçim tablosu kullanılarak seçim kolaylıkla yapılabilir. Herhangi bir özel uygulamaya uygun modun kısmen numunenin moleküler ağırlığına ve kısmen de fiziko-kimyasal karakterine bağlı olduğu görülebilir. Esasen, aşağıda kısaca özetlenen dört ana ayrım kategorisi vardır.
HPLC çalışma prensibi HPLC ile yapılan Analizler HPLC kolon seçimi Hplc Nedir HPLC PDF HPLC pik yorumlama HPLC sonuç değerlendirme yüksek performanslı sıvı kromatografisi (hplc)