Mobil fazın bileşiminin ayarlanması, mobil faz, örnek moleküller ve sabit faz arasındaki spesifik etkileşim türlerinin geliştirilmesine veya azaltılmasına izin verir; bu şekilde optimal bir kromatografik ayırma elde edilebilir.
Bir prostaglandinin çeşitli izomerik formlarının ayrılmasındaki argentasyon HPLC potansiyeline bir örnek gösterilmektedir, burada 8-izo-PGE2, 11-epi-PGE ,, 5-trans-PGE’nin p-nitrofenasil esterleri PGE ve PGF, ayrılmıştır.
Trans çift bağlara sahip bileşiklerin, karşılık gelen cis izomerlerinden daha kısa tutulma sürelerine sahip oldukları not edilmelidir, çünkü muhtemelen ikincisi gümüş iyonları için daha büyük bir afiniteye sahiptir. Argentasyon HPLC, prostaglandinlerin izotopik türlerinin ayrıştırılmasında da kullanılabilir; böylece hem döteryumlanmış hem de trityumlanmış prostaglandin türleri çözülebilir.
Çeşitli izotopik türler arasındaki tutulmadaki farklılıkların, karbon-hidrojen, karbon-döteryum ve karbon-trityum bağlarının farklı uzunluklarında olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, karbon-trityum bağı üç türün en kısası olduğundan, tritiatlı numuneler, bağlı gümüş iyonları ile daha güçlü etkileşimler ve dolayısıyla daha uzun tutma süreleri gösterme eğilimindedir.
Özet olarak, argentasyon HPLC, prostaglandinlerin izolasyonu ve kantitasyonu için geleneksel ters fazlı kromatografiye faydalı bir alternatif sağlar.
Bu tekniğin başlıca avantajları, yalnızca doymamışlık derecelerinde farklılık gösteren veya aynı bileşiğin cis-trans izomerlerinin mevcut olduğu bileşikler için daha iyi bir çözünürlük sağlamasıdır. Ayrıca, mobil fazlar uçucu organik çözücüler kullandığından, teknik uygun şekilde prostaglandinlerin hazırlanmasında kullanılabilir.
Tekniğin en büyük dezavantajı, kolon üzerinde kirliliklerin birikerek kolon geri basıncının artması ve bunun sadece kolon yıkama prosedürünü değil, aynı zamanda kolonun gümüş nitrat ile yenilenmesini de gerektirmesidir.
Argantasyon HPLC’nin ikinci bir dezavantajı, TxB ve 13,14-dihidro-15-okso-PGF dahil olmak üzere belirli bileşiklerle, nispeten kısa tutulma süreleri ile birlikte geniş veya çoklu piklerin elde edilmesidir. Bununla birlikte, özet olarak, teknik, normal faz veya ters faz kromatografisine faydalı bir alternatif sağlayabilir.
Fitanik asit
Eikozanoidler Farmakoloji
Arakidonik asit
Araşidonik asit sentezinde kullanılan enzimler
Araşidik asit
Eikozanoidler ppt
Eikozanoidlerin sınıflandırılması
Araşidonik asit trombosit
Prostaglandinlerin ve Türevlerinin Tespiti
Prostaglandinlerin tespit edilmesinin en basit yöntemi, maksimum absorbanslarının dalga boyu olan 192 nm’de UV absorbanslarını ölçmektir, ancak PGA ,, 15-keto-PCE2 ve PGB de 217, 228 ve 278 nm’de belirgin maksimuma sahiptir. kimlik tespiti için faydalı olabilir.
UV absorpsiyonu ile tespit edilebilen minimum miktar, açık bir şekilde, detektörün hassasiyeti, numunenin saflığı ve mobil fazın UV şeffaflığı dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır, ancak optimal koşullar altında tespit limiti yaklaşık 10 ng’dir.
UV saptamanın hassasiyetini iyileştirmeye yönelik teknikler, daha düşük dalga boylarında mobil fazların emilimi bir sorun olabileceğinden, 192 nm’den daha yüksek dalga boylarında ölçüme izin veren türetme prosedürlerine dayanmaktadır. 254 nm’de UV tespitine izin vermek için birkaç farklı türev hazırlanabilir:
- (a) yaklaşık 4 ng’lik bir alt saptama limiti sağladığı bildirilen 2-Naftalasil esterler.
- (b) p-Nitrofenasil esterler; alt saptama sınırı belirtilmemesine rağmen, muhtemelen düşük nanogram aralığındadır.
- (c) 3000 ng’nin altında bir alt saptama sınırına sahip p-Bromofenasil esterler.
- (d) prostaglandinde bulunan çift bağların sayısına bağlı olarak 25 ile 225 ng arasında daha düşük bir tespit sınırı olan p-Nitrobenziloksimler.
- (e) Son olarak, en yüksek UV duyarlılığını sağlayan türevlendirme prosedürü, p- (9-antoiloksi) -fenasilbromür (önemsiz ad, panasil bromür) ile bir ester oluşturmaktır. Eikosanoid esterlerin UV saptamasının alt sınırının 280 pg olduğu bildirilmektedir.
Yukarıda açıklanan panasil esterler, 413 nm’lik bir kesme filtresi ile 249 nm’lik bir uyarma dalga boyu kullanılarak florimetri ile de tespit edilebilir. Bu koşullar altında, eikosanoid esterlerin alt tespit sınırının yaklaşık 50 pg olduğu bildirilmektedir.
Florimetrik saptamaya izin verdiği bildirilen diğer iki türevlendirme ajanı, 7-bromo-7-metoksikumarin ve 4-bromometil-7-asetoksikumarindir.
Prostaglandinlerin mikrogram miktarlarını ölçmek için kırılma indisi detektörleri kullanılmıştır ve son teknolojik gelişmeler, bu yöntemi kullanarak prostaglandinlerin tespitinin hassasiyetinde önemli bir artışa izin vermelidir.
Son olarak, belirli değişkenlerin prostaglandin biyosentezi üzerindeki etkisini izlemek için in vivo veya in vitro tekniklerin uygulandığı durumlarda, radyoaktif olarak etiketlenmiş [14C] – veya [3H] -arakidonik asit, deneyin başlatılmasından önce bir prostaglandin öncüsüdür.
Bu tekniği kullanarak, etiketlenmiş araşidonik asit sentezlenmiş prostaglandinlere dahil edilir ve daha sonra doğrudan bir radyoaktif akış monitörü kullanılarak veya dolaylı olarak sonraki sintilasyon sayımı ile bir fraksiyon toplayıcı kullanılarak tespit edilebilir.
Radyoaktif izleme kullanan tespit limitleri, öncü olarak yüksek spesifik aktiviteye sahip araşidonik asit kullanılarak pikogram seviyesinin altına düşürülebilir. Ayrıca, radyoaktif izleyicilerin kullanımı, kromatografik analizden önce türevlendirme prosedürlerine duyulan ihtiyacı ortadan kaldırır.
Hidroksiikosatetraenoik asitlerin (HETE’ler) HPLC ile ayrılması ve tespiti
Ters faz, normal faz ve gümüş iyonu yüklü katyon değişimi dahil olmak üzere HETE’lerin kromatografik ayrılması için üç farklı kromatografik mod uygulanmıştır.
HETE’lerin saptanması için teknikler ve duyarlılık sınırları genellikle prostaglandinler için bildirilenlere benzerdir, ancak 235 nm’de UV izleme, konjuge dien varlığı nedeniyle mümkündür. Bununla birlikte, konjuge olmayan grupların varlığından dolayı, 190 nm’de ikinci bir abzorbansa da sahip oldukları bilinmelidir.
Ters fazlı HPLC, şüphesiz HETE’lerin ayrılması için en popüler tekniktir ve bunların kromatografisi için kullanılan koşullar, prostaglandinler için kullanılanlara temelde benzerdir; bununla birlikte, HETE’ler daha az polar olduğundan, elüsyonlarını kolaylaştırmak için mobil fazdaki organik modifiye edici konsantrasyonunun arttırılması gerekir.
Organik modifiye edicinin kesin konsantrasyonu, kullanılan spesifik durağan faza ve gerçekleştirilen kesin ayırmaya bağlıdır; örneğin, bir Ultrasphere ODS kolonu kullanılarak, asetonitril -% 0.1 sulu asetik asidin bir mobil fazının, verilen dizide 15-HETE, 1ZHETE ve 5-HETE ayrıştırdığı bildirilmiştir.
Benzer şekilde Eling ve ark. (1982), asetonitril-suyun mobil fazı, pH 3.5 kullanılarak gösterilen elüsyon sırasına göre 15-HETE, 12-HETE, 11-HETE ve 5-HETE’yi ayırmak için bir Radyal Pak-A kartuş kullandı. 15-HETE, 11-HETE, 12-HETE, 9-HETE ve 5-HETE ile ayrıştırılmış 35-50 dakikalık tutma süreleri ile bir Techsphere 5 c kolonu ile pH 5.3, metanol-su-asetik asit içeren bir mobil faz ve 5,12-di-HETE izomerleri 10 ile 15 dakika arasında yıkanabilir.