Numune dilüsyonuna karşı liziz yüzdesinin grafiğini çizerek elde edilen eğriyi tanımlayan von Krogh denklemi kullanılarak, %50 hemoliz elde etmek için gereken numune dilüsyonu hesaplanır ve ilk numune dilüsyonu dikkate alındıktan sonra bu değer CH50 birimlerine çevrilir.
Elde edilen CH50 birimi, hücreleri duyarlı hale getirmek için kullanılan antikorun miktarına ve doğasına, eritrosit konsantrasyonuna ve kırılganlığına, iyonik kuvvete, iki değerli katyon konsantrasyonuna ve tamponun pH’ına, reaksiyon süresine ve sıcaklığa bağlıdır.
CH50 ve APH50 testleri, bir hastanın bir tamamlayıcı bileşeninde genetik olarak eksik olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Bir CH50 testinde sıfır değeri, ancak APH50’yi değil, C1, C4 veya C2 eksikliğini gösterirken, normal bir CH50 sonucu ve sıfır APH50 için, bir propordin veya faktör D eksikliği mevcut olabilir (faktör B eksikliği tarif edilmemiştir).
Her iki tahlilde de parçalanma olmaması, C3, C5, C6, C7 veya C8 eksikliğini gösterir. C9 eksikliğinde düşük seviyelerde lizis oluşabilir. Sıfırın üzerindeki düşük değerler, sistemik lupus eritematozus gibi bir hastalık sürecinde tüketim nedeniyle bir veya daha fazla kompleman bileşeninin seviyesinin düştüğünü veya bir heterozigot eksiklik durumunu gösterebileceğini gösterir (bu bireylerde kompleman seviyeleri değişken olabilir, ancak birçok bileşen akut faz proteinleridir).
Kompleman-eksik serum kullanan bireysel bileşenler için hemolitik testler
Bireysel bileşenlerin varlığı ve fonksiyonel aktivitesi için testler, EA ve seçilen bileşende eksik olan bir serum kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bir test örneğinin seri dilüsyonları eklenir ve EA’nın parçalanması yalnızca test edilen bileşen mevcut ve işlevsel ise gerçekleşir.
Diğer bileşenler fazla miktarda bulunur, bu nedenle parçalanma, test bileşeninin miktarıyla orantılıdır. Eksik serum ticari olarak temin edilebilir, ancak bu tür testler düzenli olarak yapılırsa laboratuvarda da hazırlanabilir. Bu tür testler, aşağıda açıklananlardan daha düşük hassasiyete sahiptir ve düzenleyici bileşenler (C1-inh, faktör H ve I, properdin) için uygun değildir.
Önceden hassaslaştırılmış EA kullanan bireysel bileşenler için hemolitik testler
Eritrositler, test edilene kadar erken yol bileşenleri ile önceden duyarlı hale getirilebilir. Araştırılmakta olan bir bileşen içeren bir numune eklenerek, bu bileşen aktif hale getirilebilir veya halihazırda mevcut olanlar tarafından bağlanabilir.
Test bileşeni mevcut ve işlevsel ise, kalan bileşenlerin eklenmesi parçalanma ile sonuçlanacaktır. Diğer tüm bileşenlerin fazla olması sağlanarak, parçalanma derecesi test bileşeni miktarıyla orantılıdır.
İşlevsel olarak saf bileşenler laboratuvarda hazırlanabilir, ancak çoğu ticari olarak mevcuttur. En yaygın olarak kullanılan önceden duyarlı hale getirilmiş EA’lar EAC1, EAC4 ve EAC14’tür. EAC1’ler, kalsiyum ve magnezyum içeren düşük iyonik kuvvetli bir tampon içinde EA’ya C1 (örn. 5 mM CaCl çökeltilmiş kobay serumundan) eklenerek hazırlanır.
EDTA mevcudiyetinde insan serumu eklenmesi, C4 ve C2’nin bağlanmasıyla sonuçlanacaktır ve ardından 37°C’de inkübasyon, hücrelerden C1 ve C2’nin bozulmasına neden olarak EAC4’ü terk edecektir. EAC14 hücreleri, yine kalsiyum ve magnezyum varlığında ilave C1 eklenerek hazırlanır.
Otoimmün hemolitik anemi Nedir
Coombs testi Nedir
Coombs testi pozitif ne demek
Coombs testi pdf
Direct Coombs test
Hemolitik anemi: kan değerleri
Otoimmün hemolitik anemi ppt
Coombs testi pozitif çıkanlar
EAC4 hücreleri, test numunesinin seyreltilerini ve ardından kobay C2’yi ekleyerek C1 aktivitesini test etmek için kullanılır. Hemoliz, genellikle EDTA (Crat-EDTA) içeren sıçan serumu formunda kalan bileşenlerin eklenmesiyle sağlanır.
Test edilen bileşenin etkin moleküllerinin konsantrasyonu, test edilen bileşenin seyreltisine karşı Z değeri [ln(%1 lizis)] çizilerek ölçülür. Elde edilen düz çizgi grafiği, tek bir etkili tamamlayıcı molekülün (C1-C9) hücre lizisi ile sonuçlanmasıyla ‘tek vuruş teorisinden’ elde edilir.
Komplemanın bir birimi, o bileşen için bir tahlilde %63 lizis veren olarak alınır. Düz çizgi grafiği elde edilmezse, test edilen bir veya daha fazla bileşenin konsantrasyonu sınırlıdır.
C4, EAC1 kullanılarak test numunesi, gine domuzu C2 ve Crat-EDTA’nın C1 için olduğu gibi seyreltiler eklenmesiyle test edilirken, C2 aktivitesi EAC14 kullanılarak ölçülür.
Bu durumda hücreler için Tmax süresi (maksimum C4b2a oluşumu için süre) bilinmelidir. Tmax, hücreler üzerinde mevcut olan C4b miktarına bağlı olduğundan EAC14’ün partiden partisine değişir. C3 aktivitesini test etmek için EAC142’nin oluşturulması gereklidir. Bu hücreler üzerindeki C4b2a kompleksi, çoğundan daha kararsızdır, bu nedenle EAC14oxy 2, C2’nin artan hemolitik aktivitesini sağlamak için hazırlanır.
EAC14, alternatif yol bileşenlerinin fonksiyonel tahlillerinin başlangıç noktasını oluşturur. EAC1423’ü oluşturmak için C2 ve C3 eklenir, ardından EDTA tamponu içinde inkübasyon yoluyla C1 ve C2 çıkarılır. Elde edilen EAC43b, faktör B, faktör D ve uygundin eklenirse alternatif bir yol, C3 dönüştürücü oluşturur.
Crat-EDTA eklenerek hemoliz sağlanır. Faktör B, faktör D veya uygundin aktivitesi, ilgili saf bileşenin çıkarılması ve bunun yerine test numunesinin dilüsyonları ile değiştirilmesiyle ölçülür, ancak bu yöntem serum faktör D’yi test etmek için uygun değildir, sadece saf müstahzarlar.
Terminal bileşenleri, C3 ve test edilene kadar olan terminal bileşenleri, EAC14oxy 2’ye eklenerek test edilir. Bununla birlikte, C9 aktivitesini ölçmek için kullanılan EAC1-8, spontan lizise uğrayacaktır, bu nedenle hazırlandıkları anda kullanılmaları gerekir.
Kompleman Fonksiyonunun Diğer Tahlilleri
Klasik yol aktivitesinin ölçümü, ticari kitler kullanılarak mümkündür. Bunlardan bazıları ELISA bazlıdır ve serum tamamlayıcısı, kuyuda bulunan immün kompleksler tarafından aktive edilir. Üretilen, genellikle C9 olan bir terminal bileşen neoantijenin miktarının ölçülmesi, aktiviteyi değerlendirir.
Otomatik bir sistem, antikor lipozom üzerindeki antijenle reaksiyona girdiğinde yalnızca klasik yolun tamamı mevcut olduğunda salınan bir enzim (G6PDH) içeren lipozomları kullanır. Enzimin reaktif karışımındaki bir substrat ile reaksiyonu, klasik yolun aktivitesi ile orantılı bir renk değişikliği verir.
Yazarlar, APH50 için herhangi bir otomatik yöntemden habersizdir. MBL, koyun RBC’sini mannan ile kaplayarak ve testin geri kalanını bir CH50’ye göre gerçekleştirerek fonksiyonel olarak test edilebilir. MBL’nin C4’ü aktive etme yeteneğini ölçen alternatif bir fonksiyonel tahlil tarif edilmiştir. Mannan bir ELISA plakasına kaplanır ve eklenen serumdan üretilen C4c miktarı ölçülür, tampondaki yüksek tuz konsantrasyonu klasik yol aktivasyonunu önler.