Geleneksel floresan detektörü aşağıdaki bileşenlerden oluşur:
(1) Bir ışık kaynağı, ksenon veya cıva arkı veya kuvars halojen.
(2) Bir filtre veya monokromatör kullanan bir dalga boyu seçici 254 nm ve 520 nm (eksitasyon) ve 420 nm ve 680 nm (emisyon) arasında bir dizi filtre mevcuttur. Işık, numuneden her yönde yayılır, ancak genellikle eksitasyon radyasyonuna dik açılarda izlenir. Bu, daha az ışık görüldüğü için daha düşük bir hassasiyetin elde edildiği anlamına gelebilir; bununla birlikte, küvet bölmesinin içine bir parabolik reflektör yerleştirilirse, daha fazla ışık toplanabilir.
(3) Bir fotoçoğaltıcı; bu, geniş bir dalga boyu aralığında iyi hassasiyet sağlar.
(4) Boyutu 1 ila 40 µl arasında değişebilen bir numune hücredir.
Diğer yenilikler, geleneksel ışık kaynaklarından daha monokromatik olan ve bu nedenle yabancı ışıktan etkilenmeyen bir lazer ışık kaynağının piyasaya sürülmesidir. Floresan detektörlerinin artan hassasiyeti, mobil fazda kirletici materyalin varlığının büyük bir problem haline gelebileceği anlamına gelir. Bunu engellemenin bir yöntemi, çözücüleri kullanımdan önce bir flüoresan reaktif üzerinde damıtmaktır.
Kırılma İndisi (RI) Algılama
Kırılma indisi tespiti, HPLC'de kullanılan en popüler ikinci tahribatsız yöntemdir. RI tespiti, farklı matrislerden geçerken bir ışık demetinin yönündeki değişiklik ilkesini kullanır. Bu değişikliği izlemek için farklı yöntemler kullanılmıştır.
Fresnel prizması
Bu yöntem, bir cam prizmanın yüzeyinden ve hareketli fazdan iletilen ışık miktarındaki değişikliği ölçer. İki paralel ışık demeti prizmadan geçerek detektöre odaklanır.
Arayüzden iletilen ışık dağıtılır ve yansıyan ışığı bir fotosel üzerine odaklamak için bir toplama merceği kullanılır. Çözünen madde numune hücresinden geçtiğinde, ışık huzmesi farklı bir şekilde kırılır. Işık kaynağı olarak bir tungsten lamba kullanılır. Bu tür cihaz, Laboratuvar Veri Kontrolü tarafından sağlanır.
Maddelerin kırılma indisi değerleri
Camın kırılma indisi
Kırılma indisi formülü
Dalga boyu kırılma indisi ilişkisi
Havanın kırılma indisi
Işığın kırılma indisi formülü
Kırılma indisi Soruları
Renklerin kırılma indisi
Sapma refraktometresi
Bu yöntem, paralel bir ışık demetinin iki ortamın ara yüzünü geçerken kırılmasını ölçer. Bir tungsten lambadan gelen bir ışık huzmesi akış hücrelerinden geçirilir ve geri yansıtılır ve bir fotosel üzerine odaklanır. Akış hücrelerinden biri referans hücre, diğeri ise örnektir. Çözünen madde numune hücresine girdiğinde ışık saptırılır. Bu tür bir alet Su tarafından sağlanır.
İnterferometrik refraktometre
Bu yöntem, hücrelerden geçtikten sonra iki ışının girişimiyle örnek ve referans arasındaki iki ışık ışınının geçiş hızındaki farkı ölçer. Işık huzmeleri akış hücrelerinden geçer ve yeniden birleştirilir ve bir fotoçoğaltıcıda toplanır.
Örnek ve referans arasındaki bağıl ışık hızı değiştikçe, ışınlar asenkron hale gelir, iki ışının paraziti yıkıcı hale gelir ve fotoçoğaltıcıya ulaşan enerji azalır (Optilabs).
Bu kategorilere yapılan son eklemeler, hem Fresnel optiği hem de saptırma refraktometresinin (LKB) bazı özelliklerini içermektedir. Düzenleme gösterilmiştir. Kırılma indisi monitörlerinin, gradyan kromatografisi ile kullanılamaması gibi büyük bir dezavantajı vardır.
Ek olarak, sıcaklık ve basınç değişikliklerinden kaynaklanan taban çizgisi kayması da bir sorundur; bununla birlikte, izokratik ayırmalar için (özellikle boyut dışlama kromatografisinde) yöntem basittir ve genellikle sorunsuzdur. Ancak hassasiyet mikrogram aralığındadır.
Radyoaktivite Monitörleri
Radyo-etiketli bileşikler sıklıkla metabolik yolları, ilaç farmakokinetiğini ve farmakodinamiği analiz etmek için kullanılır ve ayrıca ekstraksiyon etkinliklerini ölçmek için dahili standartlar olarak kullanılır.
Son on yıla kadar, bu radyo-etiketli bileşikler, zahmetli ve zaman alan kantifikasyon tekniklerinden önce ince tabaka kromatografisi, kağıt kromatografisi veya kolon kromatografisi ile rutin olarak ayrıldı, ör. kazıma, elüsyon vb.
HPLC'nin gelişi, radyo-etiketli bileşiklerin hızlı bir şekilde ayrılmasını sağladı, ancak daha sonra bir fraksiyon toplayıcı ile numune alikotlarının toplanmasını ve ardından bir sintilasyon spektrometresinin sayılmasını gerektirdi; analiz edilecek. Daha sonra, sürekli akışlı radyoaktivite monitörleri geliştirilmiştir.
Çoğu radyoaktivite monitörü, yüksek sürekli verimlilik sağlamak için genellikle özel reflektörlere sahip iki fotoçoğaltıcı tüp arasında konumlandırılan farklı tiplerdeki akış hücrelerini kullanır. Foto çoğaltıcılardan gelen sinyal darbeleri, gürültü ve kemilüminesanstan gelen katkıları bastırmak için tesadüfen ölçülür. Fotoçoğaltıcı tüplerden gelen sinyaller güçlendirilir ve ardından genellikle çeşitli veri azaltma işlemlerine tabi tutulur.
Akış hücreleri üç şekilde mevcuttur:
Heterojen. Akış hücreleri, elüentin tam olarak UV detektörünün akış hücresinden geçtiği şekilde geçtiği katı sintilatör granülleri içerir. Radyoaktivite detektörü, bu akış hücresi ile kullanıldığında bir UV detektöründen önce ya da sonra konumlandırılabilir.
Homojen. Eluat, akış hücresinden geçmeden önce sıvı sintilant ile karıştırılır. Numune sayıldıktan sonra atığa verilir.
Yüksek enerji. Elüent, sintilatör materyalinden izole edilir, ancak akış hücresi, granüler veya sıvı sintilatör ile çevrilidir.
Faydalı seçenekler sağlayabilecek, farklı üreticilerin ekipmanlarıyla ilişkili çeşitli özellikler vardır. Birkaç üretici, bir kolondaki elüatın bir kısmının bölünmesine ve bir fraksiyon toplayıcıya götürülmesine izin veren bir ayırıcı-karıştırıcı tesisi sunar. Kolondan kalan eluatın geri kalanı daha sonra akış hücresinden geçmeden önce ölçülü bir sintilatör hacmi ile otomatik olarak karıştırılır.
Bazı makinelerin bir sınırlaması, gradyan HPLC sistemlerinde mobil fazın değişen söndürme özellikleriyle başa çıkamamalarıdır. Bazı radyoaktivite detektörleri, bir gradyan kromatografik çalışmada doğru tepe belirlemeleri vererek, DPM değerlerinin otomatik olarak hesaplanmasına izin veren standart bir eğrinin depolanmasına izin vererek bunu telafi eder.
Benzer şekilde, bu tesis, daha düşük enerjili izotopun sayma penceresine daha yüksek enerji izotopunun dökülmesini belirleyerek karma izotop izlemeye izin verir.
Artık birçok üretici, ayrıntılı veri toplama ve işlemeye izin veren mikrobilgisayarlarla bağlantılı makineleri pazarlamaktadır. Bu tesisler, çok sayıda düşük enerji zirvesine sahip olabilen bilinmeyen numuneleri izlerken son derece faydalıdır.
Radyoaktivite monitörlerinin sayım verimliliği ve algılama hassasiyeti, makineye, akış hücresinin türüne ve izotopa göre değişir. Bununla birlikte, iyi bir makinenin tipik özellikleri de gösterilmektedir.
Fizibilite Değerlendirmeleri
Çalışma yürütme sıklığı ile birlikte, çalışmanın karmaşıklığı ve personel rutini gibi hususların da hesaba katılması gerekecektir. Bu nedenle, belirli bir test (örneğin, tek bir doz, akut toksisite testi) bir test tesisinde puanla yürütülürse, bu test tesisi, bu teste “basitleştirme” önlemlerinin (bazılarının veya tümünün) uygulanmasında kesinlikle haklı olacaktır.
Bununla birlikte, başka bir test tesisinde, aynı test yalnızca her iki yılda bir gerçekleştirilecekse, bu ikinci test tesisi, bu test için GLP gerekliliklerinin uygulanmasına ilişkin özel hükümlerin hiçbirine kesinlikle uygun olmayacaktır.
Bu bağlamda, ilgili test tesisinde mevcut olan koşullara bağlı olarak, herhangi bir “kısa süreli” çalışma, “yaygın olarak kullanılan rutin yöntemlerle” bu tür çalışmalar için öngörülen özel muameleye uygun olabilir veya olmayabilir ve bu nedenle olabilir (veya be) GLP uyumlu yürütülmesini kolaylaştıran çeşitli tedbirler için uygundur.
Öte yandan, bu “kolaylaştırma süreci” kesinlikle herhangi bir çalışmanın tamamen yeniden yapılandırılabilirliği olan GLP’nin nihai amacını gözden kaçırmaya yol açmamalıdır. Bu nedenle, hangi çalışma türlerinin kısa süreli çalışmalar olarak nitelendirilebileceği sorusu biraz tartışma konusudur.
Bu yeterliliğin tartışmasız olduğu birkaç çalışma türü olabilir, ancak diğer durumlarda durum çok daha az net olabilir. Kısa süreli çalışmalarla çok kısa süreli olmayanlar arasında kesin ve kesin bir çizgi çekmek zordur. Bir yandan, genellikle gerçekten “kısa vadeli” olarak kabul edilebilecek bazı çalışma türleri vardır.
OECD’nin Kısa Süreli Çalışmalar Uzlaşı Belgesi Giriş bölümünde bu tür birkaç örnek sunmaktadır. Öte yandan, herhangi bir tek test tesisinin kendi kısa vadeli çalışmalar paketini tanımlaması veya bir Uyum İzleme Otoritesinin çalışma türlerinin bir listesini tanıması için çeşitli yollar vardır.
Bu nedenle, belirli bir çalışma türünün durumuna ilişkin genel bir anlaşmanın olmadığı durumlarda, test tesisi yönetiminin Kalite Güvencesi ile işbirliği içinde, bu sorunun nasıl ele alınacağına dair genel bir politika oluşturması mümkün olabilir. Bu politika, bu şekilde belgelendirilmeli ve ilgili çalışma türlerine belgelenmiş bir şekilde uygulanmalıdır.
Fizibilite etüdü Aşamaları Nelerdir
Fizibilite çalışması örneği
GİRİŞİMCİLİK fizibilite örnekleri
Fizibilite Nedir
Fizibilite çalışması Nedir
KOSGEB fizibilite raporu örneği
Operasyonel fizibilite
Fizibilite çalışmaları Nelerdir
Hangi çalışma türlerinin “kısa vadeli” olarak tanınacağına ilişkin karar, test tesisinin, genellikle orada yürütülen çalışmaların süresi, sıklığı ve karmaşıklığı hakkındaki kendi istatistiklerine dayanmalıdır. Bununla birlikte, bu tür kararların gerekçelerinin açıkça belirtilmesi ve belgelenmesi gerekecektir.
Kalite Güvencesi tarafından, denetimlerinin planlanması ve yürütülmesi için benzer değerlendirmeler yapılmalıdır: Bir tür büyük karmaşıklıkla ilgili nadiren yürütülen çalışmalar, kesinlikle daha yakından bakmayı hak eder ve bu nedenle, ilgili çalışmaların nispeten daha fazla sayıda olması gerekir.
Bu değerlendirme, bu çalışmaların her birinin incelenmesine karar verilmesiyle sonuçlanabilir. Öte yandan, yüksek frekanslarda yürütülen çok basit, anlaşılır ve gerçekten rutin çalışmalar, örneğin yalnızca dört ayda bir denetlenebilir. Kısa dönemli çalışmanın bu yönü, daha sonra daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır.
Özetle, bir çalışmanın, çalışmaya başlamadan önce Çalışma Direktörünün tarihli imzasıyla onaylanmış bir çalışma planının varlığı ve Kalite Güvencesi tarafından yapılan denetimler yoluyla bir miktar kontrolden geçmesi gibi belirli şartları yerine getirmesi gerekirken, Bu gerekliliklerden bazılarının yerine getirilmesinin neredeyse imkansız hale geldiği durumlar olabilir.
Bununla birlikte, bir çalışmanın deneysel süresi o kadar kısa olduğu ve ilgili denetimleri planlamanın pratik olarak imkansız olduğu ve idari iş yükünün, çalışmanın fiili yürütülmesi için iş yükünden çok daha yüksek olacağı durumlarda, GLP haklı olarak yalnızca bir yük olarak kabul edilmelidir. Bu nedenle, GLP’nin gereklilikleri, Çalışma Direktörleri, çalışma personeli ve Kalite Güvencesi için iş yükünün belirli bir şekilde hafifletilmesine izin verecek şekilde İlkeler tarafından kısa vadeli çalışmalara uyarlanır.
Herhangi bir çalışma türünün yüksek düzeyde standartlaştırılmış bir çalışma planının uygulanmasına izin verdiği düşünülebilirse, bu tür kısa süreli ise ve bir test tesisinde bu kadar sık yürütülüyorsa, çalışma personelinin bu nedenle yüksek bir dereceye sahip olması beklenebilir. Bu çalışma türünün yürütülmesinde rutin bir durum varsa, GLP prosedürleri İlkelerde belirtildiği gibi bir dereceye kadar hafifletilebilir.
Bu bağlamda, “kısa vadeli” sınırların “daha uzun” dönemle sınırlandığı, ancak sağduyunun GLP uyumu amacıyla hangi çalışma türünün yapabileceğini söylemesi gerektiği, kesin bir zaman uzunluğunu tanımlamak artık daha önemli hale geliyor. “kısa vadeli” olarak adlandırılabilir. Bu, yalnızca çalışma türünün kendisine değil, aynı zamanda test tesisine de bağlı olacaktır, çünkü diğer faktörlerin yanı sıra, dikkate alınması gereken bu tür çalışmaların fiilen gerçekleştirilme sıklığıdır.
Bir yerde bu özel gereksinimlerden yararlanabilecek bir çalışma türü, performansının nadir olması nedeniyle başka bir yerde bunu yapamayabilir. Her durumda ve her bir test tesisi için, hangi çalışmaların “kısa vadeli” olarak kabul edileceğini ve seçilen çalışma türlerini bu listeye dahil etme nedenlerini belirten bir politika belgesi olmalıdır. Aynı şey, SOP’larında “kısa vadeli” olarak kabul edilecek ve bu nedenle buna göre ele alınacak çalışma türlerini tanımlaması gereken Kalite Güvence Programı için de geçerlidir.
GLP, altında yürütülen herhangi bir çalışmanın tam bir yeniden yapılandırılabilirliğini amaçlamaktadır. Bazı çalışmaların süresi, İlkelerin tam anlamıyla uygulanmasını garanti edecek kadar sınırlı olabilir. Fizibilite değerlendirmeleri, belirli pragmatik kolaylaştırmaların tavsiye edilebilir olması gerektiği görüşüne yol açabilir.
Bununla birlikte, bazı “kestirme yollara” izin verilse bile, GLP İlkelerinin ruhu korunmalıdır. Bu nedenle, GLP İlkeleri, (idari) gerekliliklerinin yükünü azaltmaya çalışmaktadır. Kısa süreli çalışmalar için belirli bir dereceye kadar, ancak bu çalışmaların kalitesini, bütünlüğünü ve güvenilirliğini tehlikeye atmadan yapmak da gerekir.