Rutin olarak, klinik mikrobiyoloji laboratuvarı, Deney 15.1 ve 15.2’de açıklanan yöntemlerle bakteriyel duyarlılığı veya direnci test eder.
Bununla birlikte, alternatif olarak, yalnızca belirli bir organizmanın belirli bir antimikrobiyal ajana verdiği yanıtla ilgileniyorsanız (örneğin, Neisseria gonorrhoeae’den penisiline), organizmayı spesifik olarak yeterli miktarda enzim üretme yeteneği açısından test edebilirsiniz. o ilacı etkisiz hale getirir.
Organizmanın enzime sahip olduğu gösterilebilirse, söz konusu antimikrobiyal maddeye dirençli olduğu kabul edilir. Aşağıdaki deneyde, penisiline duyarlı bir organizma ve penisilinaz ürettiği için penisiline dirençli bir organizma kullanılarak böyle bir test gösterilmektedir.
Test, kromojenik (renk üreten) sefalosporin, nitrosefin içeren bir filtre kağıdı diski kullanır. Penisilin gibi sefalosporinler de beta-laktamazlar tarafından bozulur. Test diski penisilinaz üreten bir organizma ile aşılandığında, sarı nitrosefin kırılarak kırmızı bir son ürüne dönüşür.
Amaç
Bir test bakteri suşu ile penisilinaz üretimini tespit etmek için
Malzemeler
Beta-laktamaz testini gerçekleştirmek için nitrosefin emdirilmiş filtre kağıt diskleri
Steril su veya tuzlu su
Cam slaytları temizleyin
Forseps
Penisiline dirençli bir plak kültürü
Staphylococcus aureus
Penisiline duyarlı bir plak kültürü
Bacillus subtilis
Bakterilerin antibiyotiklere direnç mutasyon mudur
Bakterilerin antibiyotiklere karşı direnç mekanizmaları
Bakterilerin ilaçlara karşı direnç kazanması mutasyon mudur
Bakterilerin antibiyotiklere karşı direnç kazanması Modifikasyon mudur
Bakterilerin antibiyotik direnç mekanizmaları
Bakterilerin antibiyotiklere karşı direnç kazanması yararlı mutasyon mudur
Bakterilerde antibiyotik direncinin gelişmesini sağlayan yapı
Antibiyotik direnci
Prosedürler
1. Temiz bir cam slaytın yüzeyine iki küçük damla su veya salin koyun.
2. Forsepsinizle bir beta-laktamaz diski alın ve bir damla sıvı ile temas edecek şekilde yerleştirin.
3. Bu prosedürü ikinci bir diskle tekrarlayın ve ikinci damla sıvının üzerine koyun. Diskleri aşırı doyurmayın.
4. Sterilize edilmiş ve soğutulmuş inokülasyon özenizle, bir B. subtilis kolonisinin bir kısmını alın.
5. İkinci diskin yüzeyinin çapraz yüzünde aureuskoloninin sürtünmesine bakın.
6. Beta-laktamaz diskler üzerindeki organizmaların 30 dakikaya kadar inoküle edildiği alanları gözlemleyin. Olumlu bir sonuç genellikle 3 ila 4 dakika içinde görülür.
Sonuçlar
1. Disk üzerine sürülen bakteri üremesinin rengindeki sarıdan kırmızıya bir değişiklik, nitrosefinin bozulduğunu gösteren pozitif bir testtir.
2. Sonuçlarınızı tabloya kaydedin.
DENEY : Antimikrobiyal Ajanlara Bakteriyel Direnç: Mutasyon
Deney 15.3’te, üretimi bir bakteriyel plazmid üzerindeki bir gen tarafından yönlendirilen bir enzimden kaynaklanan bakteri direnci tespit ettiniz. Bu deneyde, bakteri kromozomu üzerindeki bir gendeki mutasyondan kaynaklanan direnci tespit edeceksiniz.
Mutasyonlar, bakteri hücresinde değişen oranlarda, genellikle 1012 bölünmede 104’te 1 ila 1 arasında meydana gelir. Bakteriler haploiddir; yani, çoğu yüksek organizmada görülen çoklu, eşleştirilmiş (diploid) kromozomların aksine, yalnızca bir eşleşmemiş kromozoma sahiptirler.
Bu haploid doğası nedeniyle, diploid organizmalarda olduğu gibi çekinik mutasyonlar oluşmaz ve bu nedenle bakteriyel mutasyonlar daha kolay saptanabilir. Ek olarak, bakteriler hızlı bir şekilde büyük popülasyonlara çoğalır (genellikle bir gecelik broth kültüründe 109 hücre), böylece mutantların kısa sürede ortaya çıkması beklenebilir.
Bakteriyel mutasyonların çoğu tanınmaz hale gelir ve mutasyon hücre için seçici bir avantaj sağlamadıkça, örneğin yabani tip (mutasyona uğramamış) popülasyon için öldürücü olan bir antimikrobiyal ajan varlığında hayatta kalma yeteneği gibi, mutantlar hayatta kalamayabilir.
Streptomisin, gentamisin gibi bakteriyel ribozom üzerinde etki ederek protein sentezini inhibe eden antimikrobiyal bir ajandır. E. coli organizmaları, sadece bir mutasyonla streptomisine dirençli hale gelir, böylece göreceğimiz gibi, bu organizma-antimikrobiyal madde kombinasyonu, kromozomal direnç mekanizmasını açıklamak için kullanım için uygundur.
Amaç
Streptomisine dirençli E. coli mutantlarını seçmek
Malzemeler
19 ml besleyici agar içeren tüpler (ilk seans)
20 ml besleyici agar içeren tüpler (ikinci seans)
49 ml besin suyu içeren şişeler
Steril petri plakaları
Streptomisin çözeltisi (20 mg / ml)
Escherichia coli’nin 18 ila 24 saatlik et suyu kültürü
1 ml pipetler
0,5 ml steril su içeren tüpler
Prosedürler
1. Bu deney sırasında, tüplerdeki agar katılaşmadan önce birkaç adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirmeniz gerekecektir. Tüpleri su banyosundan çıkarmadan önce nasıl ilerleyeceğinizi bildiğinizden emin olmak için şekil 15.3’ü önceden inceleyin.
2. Eritilmiş 3 tüp besleyici agar’ı 50 ° C su banyosuna yerleştirin.
3. İşaretleme kaleminiz, labelonetubeofmeltedagar, oneflaskofbroth, andonepetriplate “SM100” olmalıdır (bu, 100 ug streptomisin / ml ile). Başka bir erimiş agar tüpü, bir şişe et suyu ve bir petri plakası “SM 250” (250 g streptomisin / ml ile) etiketleyin. Üçüncü erimiş agar tüpünü, bir şişe et suyunu ve bir petri plakasını “No SM” (streptomisin içermeyen) olarak etiketleyin. Son tüp ve şişe, kontrolleriniz olarak işlev görür.
4. “SM100” etiketli “SM100” ve 0,25 ml streptomisintotetüp etiketli “SM 250” etiketli tüpe 0,1mlofthestreptomycinsolution ekleyin.
5. Streptomisin içeren her agar tüpüne ve streptomisin içermeyen kontrol tüpüne hemen 1 ml gecelik E. coli kültürü ekleyin. Her bir tüpü ellerinizin arasında döndürerek (sallayarak değil) iyice karıştırın ve tüplere karşılık gelecek şekilde etiketlenmiş petri plakalarına hızla dökün. Plakaları sertleşmesi için bir kenara koyun.
6. Genel etiketli “SM100” ve 0,6 ml cam etiketli “SM250” şişelerine 0,25 ml solüsyon ekleyin.
7. Streptomisin ve kontrol şişesine streptomisin olmadan her şişeye E. kolikültürü 1ml ekleyin.
8. Plakalar sertleştikten sonra (adım 5), eğitmen tarafından gösterildiği gibi kenarlarının etrafını Parafilm şeritleriyle kapatın.
Tüm plakaları ve şişeleri 35 ° C’de inkübe edin. Bir sonraki seansta, streptomisine dirençli kolonilerin olup olmadığını belirleyeceksiniz.
9. İşlemleri yineleyin.
10. Altı petri kabının altını şu şekilde etiketleyin (şekle bakın): “agar SM 100,” “agar SM 250,” “agar No SM,” “broth
SM 100, “” broth SM 250 “,” No SM etiketi ekleyin. ” Şimdi 6 plakanın her birini işaret kaleminizle üç bölüme ayırın. Her plakanın bölümlerini şu şekilde etiketleyin: “SM 100”, “SM 250,” “SM Yok.”
11. “SM 100” etiketli iki erimiş agar tüpünün her birine (adım 9) 0,1 ml streptomisin solüsyonu ekleyin. Birini içine dökün
“agar SM 100” etiketli petri plakası ve “broth SM 100” etiketli plakaya bir tane ekleyin.
12. “SM 250” etiketli erimiş agarın her iki tüpüne 0,25 ml streptomisin solüsyonu ekleyin.
11. adımdaki “SM 250” etiketli uygun plakalara koyun.
13. Streptomisin içermeyen son iki agar tüpünü ilgili petri plakalarına dökün. Plakaları sertleşmesi için bir kenara koyun.
14. Önceki seansta aşılanan brothları ve plakları inceleyin.