Rutin CE-SDS Analizi – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi – FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
40 mM’den daha yüksek konsantrasyonda numune çözeltilerinde IAM’nin varlığı, parçalanmayı daha da azaltmadı. Alkilasyon üzerine rMAb fragmantasyonunun bastırılması, rMAb’lerde bulunan serbest SH gruplarını, antikor fragmanlarının oluşumunda disülfür değişim reaksiyonlarının aracıları olarak ima eder. Alkillenmiş etiketli rMAb numunelerinin toplanma seviyesinin alkile edilmemiş kontrol numunesininkine (% 0,2) benzer olduğunu belirtmek önemlidir.
IAA (şerit 5) veya IAM (şerit 6) ile alkilasyondan önce (şerit 4) ve sonra aynı rMAb’nin gümüş lekeli SDS-PAGE profilleri Şekil 4B’de gösterilmektedir. IAM (şerit 6) ile alkilasyondan sonra bant sayısının kontrol numunelerinde 11’den (şerit 4) yaklaşık 7’ye düştüğü görülebilir. İlginç bir şekilde, 20-25kDa bölgesinde görülen üç hafif zincir bandı, IAM ile alkilasyondan sonra tek bir bant halinde çöktü. Bu ayrıca, jellerde sıklıkla görülen bu çoklu bantların gerçekten de numune hazırlama yapıları olduğu hipotezini desteklemektedir. Ek olarak, bazı bantların yoğunluğunun önemli ölçüde azaldığı görüldü.
Rutin CE-SDS Analizi için
ProteomeLabTM PA800 Cihazının Optimizasyonu
Doğrulama çalışmalarının bir parçası olarak, mevcut yöntemlerin alternatif CE-SDS enstrümantasyonu ve kimyası ile uyumlu olduğunu göstermek önemlidir. Şekil 5, Beckman Coulter, Inc (Fullerton, CA) ve ProteomeLabTM PA800 CE cihazı tarafından sunulan değiştirilebilir polimer matrisi kullanılarak indirgenmemiş ve indirgenmiş rMAb numunelerinin elektroferogramlarını göstermektedir.
RMAb türlerinin hem sinyali hem de çözünürlüğü Bio-Rad sistemi ve matrisiyle elde edilenlerle karşılaştırılabilirdi (Şekil 1). Ana fark, daha viskoz CE-SDS polimer çözeltisinin kullanımından kaynaklanan ProteomeLabTM PA800 cihazında rMAb numunelerinin ayrılması için daha uzun analiz sürelerinin gerekmesiydi.
ProteomeLabTM PA800 cihazının fizibilitesi ve kolon öncesi etiketleme ve LIF tespiti ile rMAb’lerin CE-SDS analizi için yeni ayırma matrisi gösterilmiş olsa da, rutin analiz için cihaz performansını ciddi şekilde sınırlayan birkaç sorun gözlenmiştir.
SDS-PAGE aim
Native PAGE nedir
SDS-PAGE purposes
Poliakrilamid jel elektroforezi nedir
Elektroforez Makale
SDS-PAGE gel
Elektroforetik YÖNTEMLER nelerdir
Elektroforez ne amaçla kullanılır
Basınç Arızası Hataları
ProteomeLabTM PA800 cihazı, toplam 10 kopya enjeksiyonla beş farklı etiketli rMAb örneğinden oluşan bir diziyi analiz etmek için kuruldu. Çoğu durumda, enjeksiyonların yaklaşık% 60’ının elektroforetik analizi, cihazdaki “basınç hataları” nedeniyle gerçekleşmedi.
Daha yakından incelendiğinde, jel matris içeren şişelerin bazı kırmızı kauçuk kapakları eksikti, elektrotlar büküldü ve kılcal damarlar kırıldı. Ek olarak, arayüz bloğunun yapışkan bir jel matris filmi ile kaplandığı gözlendi. Jel tampon oluşumunun, kırmızı kauçuk kapakların ara yüz bloğuna yapışmasına ve sonraki aşamalarda şişelerin temasına müdahale etmesine neden olduğu aşikardı.
Jel tamponunun uzaklaştırılmasını iyileştirmek için arayüz bloğu ve çevreleyen alanlar deiyonize su ile dikkatlice yıkandı. Ardından, arayüz bloğunun alt tarafındaki olukları silmek için pamuklu çubuklar kullanıldı. Son olarak, KimwipeTM ile kaplı kırmızı kapaklı bir tampon flakonu, flakonu döndürerek oluklardan kalan suyu çıkarmak için kullanıldı.
Temizleme prosedürü en az üç kez tekrarlandı. 10 ardışık enjeksiyonun analizinden önce arayüz bloğunun özenle temizlenmesi, yukarıda açıklanan sorunların ortadan kaldırılmasıyla sonuçlandı.
Zirve Kuyruk Sorunları
Analiz verimini büyük ölçüde azaltan bir başka sorun da, en yüksek veri takibiydi. Pik artıkları, elektroferogramlarda gözlemlenen zirveleri doğru bir şekilde ölçme yeteneğini bozar. Şekil 6, aynı indirgenmemiş rodamin etiketli rMAb numunesinin altı ardışık enjeksiyonunun LIF tespitiyle CE-SDS elektroferogramlarını göstermektedir. İkinci ve beşinci enjeksiyonların analizi sırasında monomerin pik kuyruğu gözlemlendi.
Bu sorun, 10 örnek enjeksiyonluk belirli bir dizinin analizinden elektroferogramların% B40’ında gözlenmiştir. Ek olarak, bu fenomen, LIF veya UV saptaması kullanılarak ve hem indirgeyici hem de indirgeyici olmayan koşullar altında rMAb numunelerinin analizi sırasında görülmüştür. Muhtemelen bir numune enjeksiyonundan sonra kapiler ve elektrot yüzeylerinin dışında kalan numunenin eksik çıkarılmasının neden olduğu olası bir tepe tortusu kaynağı, taşınmadır.
Şekil 6’da gösterilen verileri oluşturmak için kullanılan yöntem, kılcal damarların dışındaki herhangi bir kalıntı numuneyi çıkarmak için halihazırda bir suya daldırma adımını içeriyordu. Zirve atık sorunu hala devam ettiğinden, numune enjeksiyonu ve sonraki suya daldırma adımları sırasında kılcal ve elektrot ile temas halinde olan sıvı seviyelerini araştırdık.
Şekil 7’de gösterildiği gibi, numune şişesinin tabanı ile numune şişesinin içine yerleştirilen PCR tüpündeki 100 mL numunenin menisküsü arasındaki mesafe B19 mm idi. Öte yandan, 2.0 mL’lik şişenin tabanı ile daldırma aşaması için şişeye eklenen 1.3 mL deiyonize suyun menisküsü arasındaki mesafe B15 mm idi. Bu, üretici tarafından önerilen su hacmidir.
Sonuç olarak, enjeksiyon sırasında numuneye maruz kalan, suya daldırma adımında durulanmayan yaklaşık B6 mm kılcal ve elektrot vardır. Bu fenomen, 100 mL’den daha büyük numune hacimleri kullanılırsa daha belirgindir. Kapiler ve elektrotun dış yüzeylerinin durulanmasını iyileştirmek için, 2.0 mL daldırma şişesindeki su hacmi 1.9 mL’ye yükseltildi ve enjeksiyon için numune hacmi 75 mL’ye düşürüldü. Bu değişikliklerin CE-SDS yöntemine uygulanması ile Şekil 6’da görülen sorunlar giderilmiştir.
Ani Zirveler ve Geçiş Süresi Değişkenliği
Geriye kalan son engeller, aynı rMAb örneğinin herhangi bir 10 ardışık enjeksiyonunun yaklaşık% 20’sinde göç zamanı kaymaları ve / veya ani artışlardır. Şekil 8, indirgeyici olmayan koşullar altında hazırlanan aynı rMAb örneklerinin 1, 4 ve 9 enjeksiyonlarının elektroferogramlarında gözlemlenen tipik sivri uçları gösterir. Ek olarak, monomer zirvesi için geçiş süresinin RSD’si% B2 idi. İndirgenmemiş rMAb numunelerinin analizi sırasında da bu sorunların gözlemlendiğini belirtmek önemlidir.
Muhtemel bir göç zamanı kaymaları ve sivri tepeler kaynağı, kılcalın girişine kabarcıkların girmesiydi. Belirli bir rMAb numunesinin analizi için jel yükleme aşaması sırasında, kartuş cihazdan çıkarıldı ve kapiler giriş 20 büyütmede incelendi.
Bir balon görsel olarak doğrulandı. Satıcı, jel tamponunun kapiler içerisine giriş tarafında bulunan bir şişeden (numunelerin enjekte edildiği bölüm) 70 psi’de yüklenmesini önerir. Çıkıştan jel yüklemesi, değiştirilebilir polimer solüsyonları kullanılarak DNA dizilimi için CE yöntemlerinde uygulanabilir bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır.
Beklendiği gibi, ters jel yüklemeli modifiye bir yöntem kullanılması, elektroferogramlardaki ani yükselmeleri ortadan kaldırdı. Ek olarak, ters jel yüklemesi kullanılarak aynı rMAb numunesinin 10 ardışık enjeksiyonunun CE-SDS analizi sırasında monomer zirvesi için migrasyon süresinin değişkenliği% 0.5’ten azdı.
Elektroforetik YÖNTEMLER nelerdir Elektroforez Makale Elektroforez ne amaçla kullanılır Native PAGE nedir Poliakrilamid jel elektroforezi nedir SDS-PAGE aim SDS-PAGE gel SDS-PAGE purposes