Numunelerin Boyanması – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Her durumda, bir cam slayt üzerine ince bir smear yapılır ve doğal olarak veya çok mütevazı bir ısıda kurumaya bırakılır, ardından smear, bir Bunsen alevinden hızlı bir şekilde üç kez geçirilerek veya ısıtılmış bir tabak olmalıdır.
Birkaç modifikasyona sahip olan Gram boyama yöntemi, smearın art arda şu şekilde işlemden geçirilmesini içerir: (a) genellikle kristal viyole olan temel bir pozitif yüklü boya; (b) sulu iyot ile mordanlama; (c) aseton ile renk açma; ve (d) karbol fuksin veya safranin ile zıt boyama.
Numunelerin Boyanması
Çoğu bakteri başlangıçta bakteri hücresi içinde çözünmez kompleksler oluşturan kristal mor ve iyot ile boyanır. Hücre duvarlarında kalın peptidoglikan katmanlarına sahip olan ve bu nedenle asetonla işlemden sonra lekeyi tutan ve bu nedenle mor görünen bakteriler, Gram-pozitif olarak tanımlanır; Kompleksi aseton ile kolayca kaybeden ve dolayısıyla pembe zıt boyayla lekelenen daha ince peptidoglikan tabakalarına sahip olanlar Gram-negatif olarak adlandırılır.
Her ikisinin örnekleri Tablo 10.1’de verilmiştir. Bazı bakteriler Gram boyayla (örn. Legionella türleri) zayıf bir şekilde boyanır, bazıları boyama davranışlarında tutarsızdır (Gram değişken; örn. Gardnerella vaginalis) ve diğerleri hiç boyanmaz (örn. Mikobakteriler).
Mikobakteriler için yüksek konsantrasyonlarda mikolik (yağlı) asit içeren hücre duvarlarının kendine özgü bileşimi nedeniyle özel boyama yöntemleri gereklidir. Ziehl – Neelson boyası, filmin sıcak karbol fuksin ile işlenmesini, ardından konsantre sülfürik asit ve alkol ile ardışık renk giderme adımlarını ve son olarak malakit yeşili veya metilen mavisi ile zıt boyanmayı içerir. Mikobakteriler, yeşil veya mavi bir arka planda kırmızı görünür.
Mikobakteriler için kullanılan diğer boyama yöntemi fenol-auramindir. Bu, numunenin kurutulmuş ve ısıyla sabitlenmiş yaymalarının (genellikle balgam, plevral ve asit sıvılar, sabah erken idrar, CSF, irin, vb.), Endüstriyel metillenmiş alkolde% 1 hidroklorik asit ile renklerinin giderilmesi, fenol-auramin ile işlemden geçirilmesini içerir. ardından seyreltik bir potasyum permanganat çözeltisidir.
Filmler, hedef kullanılarak ultraviyole ışık altında izlenir ve mikobakteriler koyu bir arka plana karşı yeşil-sarı renkte parlar. Bu teknik, bir smearın hızlı taranmasını sağlar ve örnekteki bakteri sayısı az olduğunda faydalıdır.
Floresan mikroskobu çalışmasında diğer iki boyama yöntemi kullanılır – akridin turuncusu ve floresein – antikor konjugatları. Akridin turuncusu ile boyama, bir Gram boyamada net bir şekilde görülmeyen bakterileri göstermek için yararlı bir yöntemdir (kan kültürlerinde olduğu gibi; aşağıya bakınız). UV ışığı altında bakteri turuncu görünür.
Florasin-antikor konjugatlarını kullanan iki ana immünofloresan teknik mevcuttur, doğrudan ve dolaylı floresan antikor testleri (sırasıyla DFAT ve IFAT). DFAT, doğrudan bakteriyel yüzey antijenine bağlanan özel bir antikora konjuge edilmiş bir florokrom, yaygın olarak floresein izotiyosiyanat kullanır.
IFAT iki aşamalı bir prosedürdür: spesifik antikor (örneğin bir tavşanda hazırlanan) antijene bağlanır ve kendisi bir konjuge antikor (örn. Anti-tavşan) tarafından tespit edilir. IFAT’ın avantajı, tek bir konjuge antikorun bir dizi spesifik antikoru saptamak için kullanılabilmesidir.
Klinik bakteriyolojide, bu immünofloresan tekniklerin başlıca kullanımları, (a) zor üreyen ve büyümesi yavaş olan ancak balgam, bronko-alveolar lavajlar ve akciğer dokusunda (taze veya formalin- sabit), DFAT veya IFAT kullanarak; ve (b) genital veya solunum yolu örneklerinde doğrudan klamidya gösterimi içindir.
Lekeli preparatların mikroskopisinin klinik mikrobiyolojide kullanımına ilişkin bazı başka örnekler aşağıda verilmiştir.
Numune Boya Makinası
Ht NUMUNE BOYAMA makinesi
Normalde Steril Bölgelerden Alınan Numuneler
Bu örneklerle, mikroskopi olası nedensel patojeni tahmin etmede güçlü bir araç olabilir. Beyin omurilik sıvısı, eklem aspiratı veya periton diyaliz atığındaki organizmaların bulunması, örneğin özellikle irin hücrelerinin infiltrasyonu ile birlikte olduğunda, enfeksiyonun belirli bir göstergesidir ve tek başına bakterinin görünümü tanısal olabilir.
Bu tür örneklerde bazen çok yetersiz olduklarından (örneğin 10 dakika 3000 rpm’de), süpernatant atılarak ve tortunun bir filmini oluşturarak incelenen çok kapsamlı bir bakteri araştırması yapılması gerekebilir. daha sonra Gram yöntemi ile ve ayrıca klinik durum olası mikobakteriyel enfeksiyonu düşündürüyorsa, auramin veya Ziehl-Neelson ile boyanır.
Laboratuvarların çoğu şu anda bir tür yarı otomatik kan kültürü sistemi kullanmaktadır ve bir şişeden gramla boyanmış et suyu damlasının pozitif büyüme kaydeden incelenmesi, organizmanın tanımlanmasındaki ilk adımdır.
Mikroskopi kendi başına tanısal olabilir: örneğin ateşi ve kalp üfürümü olan bir hastanın kanındaki streptokoklar, enfektif endokarditin klinik teşhisini destekler.
Öte yandan, kümelerdeki Gram pozitif koklar genellikle stafilokoklardır, ancak Staphylococcus aureus birçok koagülaz negatif türden mikroskopi ile ayırt edilemez ve ikincisi deri organizmaları olduğu için kan kültürlerinin en yaygın kirleticileridir. Bir kan kültüründe görülen stafilokokların önemi genellikle daha fazla tanımlanmayı beklemelidir.
Kan kültürlerindeki gram-negatif organizmaları, genel arka plan pembe boyamasına karşı görmek bazen zordur ve hiçbir organizma görünmediğinde, genellikle bir akridin boyası yapmak yararlıdır.
Normal bakteri florasına sahip yerlerden alınan örnekler
Oral Çubuklar
Mikroskopi, Vincent anjinasını (anaerobik stomatogingivitis) teşhis etmenin tek yöntemidir, çünkü nedensel organizmalar (enfeksiyonu üretmek için sinerjik olarak hareket eder) yapay olarak kültürlenemez. Oral sürüntü filmlerinde birçok irin hücresi ve çok sayıda spiroket ve fuziform (iğ şeklinde) Gram-negatif basil görülür.
Balgam
Tüm balgam örnekleri, tüberkül basili içerebildikleri için operatöre zarar verme potansiyeline sahiptir ve filmlerin hazırlanması Kategori 3 muhafaza laboratuarında bulunan bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir. Balgam normalde steril olan alt solunum yolundan kaynaklansa da, flora tarafından üst solunum yolundan alınmadan önce kaçınılmaz olarak kontamine olur.
Gram balgam filmlerinin yorumlanmasında dikkatli olunması gerekir ve pnömoninin nedensel organizmasını yalnızca mikroskobik incelemeye dayanarak ancak nadiren güvenle tahmin edebilirsiniz. Gram filmler yine de, skuamöz epitel hücresi başına 10’dan az nötrofil gösteren ‘balgam’ örneklerinin muhtemelen balgamdan ziyade tükürük olduğunu ve kültürün yanıltıcı olabileceğini gösterdiğinde faydalıdır.
Mikobakteriyel enfeksiyondan şüphelenildiğinde, oramin boyalı filmler incelenir ve Ziehl-Neelson yöntemi ile taze filmler yapılarak ve boyanarak pozitifler doğrulanır.
Balgamın dezavantajları, çok hasta veya bağışıklığı baskılanmış hastalarda pnömoni tanısında gittikçe artan bir prosedür olan bronkoalveolar lavaj yapılarak büyük ölçüde aşılır.
Elde edilen örnekler, kontamine edici üst solunum yolu florası içermez ve Gram, oramin ve Ziehl-Neelson boyaları ile ve Legionella türleri ve çok çeşitli protozoal, fungal ve viral patojenler için immüno-flüoresans teknikleriyle incelenebilir.
