Nükleosit Bazları – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Nükleik asit bileşenlerinin HPLC analizi, bileşenlerin kimyasal yapısına göre bölümlere ayrılabilir. Örneğin, nükleik asitler eşit oranlarda bir organik baz, bir karbonhidrat ve bir fosfat kalıntısından oluşur ve uzun polimerik zincirlere kovalent olarak bağlanır ve en uygun kromatografik modu belirleyen bu çeşitli özelliklerdir.
Bu bölümde aşağıdaki bölümlerdeki bileşenleri ele alacağız:
- nükleosit bazları,
- nükleositler,
- nükleotidler ve
- polinükleotidler (RNA ve DNA)
Doğal nükleosit bazları, beş heterosiklik aromatik bileşikten biri olabilir ve adenin, guanin (pürinler), sitozin, timin ve urasili (pirimidinler) içerir. Nükleositler, aromatik halka nitrojen atomlarından biri aracılığıyla bir karbonhidrat kısmına bağlanan bir bazdan oluşur.
Spesifik karbonhidrat, RNA’yı (riboz) DNA’dan (deoksiriboz) ayırır. Nükleotidler, nükleositlerin fosforile türevleridir ve 5 ’konumunda veya 3’ konumunda bir, iki, size veya (daha az yaygın olarak) dört veya daha fazla fosfat kalıntısı içerir.
Bu bileşiklerin ayrılması için yaygın olarak kullanılan üç HPLC modu arasında iyon değişimi, ters faz ve ters fazlı iyon çifti bulunur. PK, bazların ve nükleositlerin değerleri, tüm kromatografik modlarda tutulma sürelerinin belirlenmesinde önemli bir rol oynar ve referans için bir liste sunulur (pK ,, ve pK ,, ilk kazanıma ve bir protonun ilk kaybı). Kimyasal olarak modifiye edilmiş bir dizi nükleosit türevinin önemli biyolojik işlevleri vardır ve bu bileşiklerin birkaçı viral enfeksiyonların ve kanserin tedavisi için kullanılır; bunlar da bu bölümde tartışılacaktır.
Örnek Hazırlama
Biyolojik kaynaklardan nükleositlerin ve nükleotitlerin ekstraksiyonu geleneksel olarak buz soğukluğunda perklorik asit (veya daha az sıklıkla trikloroasetik asit) içinde homojenleştirme ile gerçekleştirilir. Bu, proteini numuneden çökeltme, nükleotitleri süpernatanda bırakma ve daha sonra santrifüjlemeden sonra çıkarılabilme avantajına sahiptir.
Süpernatan, sulu bir hidroksit veya bir amin-freon çözeltisi gibi bir alkali çözelti ile nötrleştirilebilir. Daha yeni teknikler, kimyasal modifikasyon potansiyelini ortadan kaldıran ultrafiltrasyon ile proteinin uzaklaştırılmasını içerir. Alternatif olarak, deproteinizasyon, buz gibi soğuk asetonitril ile işlemden geçirilerek gerçekleştirilebilir.
Molekülün karbonhidrat kısmının kimyasal özelliklerindeki farkı kullanarak deoksiribonükleositleri ribonükleositlerden ayırmak mümkündür. Periyodik çözelti spesifik olarak ribonükleositlerdeki cis-diol fonksiyonu ile reaksiyona girecek ve bunların etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayacaktır.
Alternatif olarak ribonükleositler, bazik pH’ta Affi-Gel 601 gibi bir boronat jel kolonuna spesifik olarak bağlanabilir ve daha sonra 0.1 M formik asit ile ayrıştırılabilir.
Pirimidin bazları
Nükleik asit
Nükleotit yapısı
Nükleotid Nedir
Nükleotit dizilimi
Adenin nükleotidi
DNA yapısı
Nükleotit çeşitleri
Zirvelerin Karakterizasyonu
Nükleozid eluent piklerinin tanımlanmasına yönelik klasik yöntemler, referans bileşiklerle tutma süresi veya “spiking” (ortak kromatografi) kullanmaktır. Ek olarak, ikinci bir kromatogramdan kaybedilen zirveleri gözlemleyerek ribonükleositleri tanımlamak için periodat ile kimyasal işlem kullanılabilir. Benzer şekilde enzimatik modifikasyon, birkaç özel durumda faydalı olabilir.
Substrat pikinin alanındaki kayıp veya azalma veya ürün pikinin alanındaki artış, bileşik tanımlamasına yardımcı olur. UV soğurma oranı (A254 / A280), bileşik tanımlama için alternatif bir yol sağlar. Bazı karakteristik oranlar verilmiştir.
Biyolojik kaynaklardan elde edilen nükleosit türevleri genellikle çok düşük seviyelerdedir ve bu sadece UV saptamanın hassasiyeti için değil, aynı zamanda tanımlama amaçları için de ciddi bir problem olabilir.
Kloroasetaldehit, 410 nm’de maksimum emisyona sahip oldukça flüoresan bir türev olan 1, N6-etenoadenin üretmek için adenin ve ilgili bileşiklerle oldukça spesifik bir reaksiyona girer. Bu yöntem, 1 pmol adenin ve ilgili nükleositlerin ve nükleotitlerin spesifik tespitine izin verir.
Nükleosit Bazları
Nükleik asit bazları genellikle karşılık gelen nükleositlerin varlığında analiz edilir, çünkü tercih edilen kromatografik modlar her iki bileşik sınıfının aynı anda ayrılması için uygundur. Başlangıçta nükleosit bazlarının polar karakterinden iyon değişimli HPLC kullanılarak yararlanılmıştır; bununla birlikte, ters faz teknikleri artık daha yaygın olarak kullanılmaktadır.
Nükleosit bazlarının, nükleositlerin ve diğer UV emici bileşiklerin ayrılmasına yönelik kromatografik tekniklere ilişkin en kapsamlı araştırmalardan ikisinde, ters faz kolonundaki 86 bileşiğin alıkonma verileri hem nitelik hem de nicelik olarak rapor edilmiştir.
Sulu bir fosfat tamponu-metanol gradyanı kullanılarak tek bir ODS kolonunda 28’e kadar bileşiğin mükemmel ayrılması elde edildi. Pürin ve pirimidin serilerinde kimyasal yapı ile alıkonma süresi arasında bir ilişki gösterilerek, tutma süresinin kimyasal yapıdan tahmin edilmesine izin verildi.
Çeşitli biyolojik sıvılardaki purin ve pirimidin metabolitlerinin konsantrasyonlarının doğru belirlenmesi, bir dizi hastalık durumunun çalışılmasına izin verir ve terapötik yaklaşımlar önerebilir. Ters fazlı kromatografiyi kullanarak, nükleosit bazlarını, nükleositleri ve nükleotitleri tek bir kromatografik çalışmada ayırmak mümkündür.
Örnekler idrar, serum ve plazma gibi fizyolojik sıvılardan elde edildi. İdrar doğrudan filtrasyondan sonra kullanıldı, ancak serum ve plazma örnekleri önce perklorik asit ile çökeltilerek deproteinize edildi ve ardından enjeksiyondan önce nötralize edildi.
HPLC ayrımı, 0,05 M fosfat tamponu (pH 5,6) ile başlayıp 0,05 M fosfat tamponu (pH 5,6) -metanol-su ile biten bir kademeli üçlü çözücü gradyanı kullanılarak bir ODS durağan fazı üzerinde test bileşikleri ile geliştirilmiştir.
Bu tekniğin Lesch-Nyhan sendromlu bir hastadan alınan idrar örneklerine uygulanması gösterilmektedir. Yıkanan bileşenler, 254 nm ve 280 nm’de bir UV detektörü ile izlendi ve her bileşenin 5-10 pmol saptanmasına izin verdi. Radyo-etiketli öncüllerin metabolik kaderi, bir radyoaktivite detektörü kullanılarak izlenebilir.
5-florourasilin dahil edildiği benzer bir örnek, nükleosit bazlarının ayrılması için sulu fosfat tamponları ile birleştirilmiş ters fazlı sistemlerin geniş uygulanabilirliğini göstermektedir.
Bu çalışma aynı zamanda, farklı izokratik koşullarla kombinasyon halinde dokuz farklı analitik ters faz kolonunun yararlı bir karşılaştırmasını içerir ve aralarındaki ince farklılıkları açıkça gösterir.
Çalışma, test bileşiklerinin çözünürlüğünü maksimize etmek için en iyi sabit fazın, seçici tampon olarak amonyum fosfat ile kombinasyon halinde Spheri-sorb ODs-2 olduğu sonucuna varmıştır.
Adenin nükleotidi DNA yapısı Nükleik asit Nükleotid Nedir Nükleotit çeşitleri Nükleotit dizilimi Nükleotit yapısı Pirimidin bazları