Kemilüminesans – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Floresan ve Fotometri
Floresan ölçümleri, absorbans ve ışık saçılım ölçümlerinden daha hassastır. Çözeltideki bir kromoforun absorbans büyüklüğü, konsantrasyonu ve küvetin yol uzunluğu ile belirlenir.
Bir floroforun floresan yoğunluğunun büyüklüğü, konsantrasyonu, yol uzunluğu ve ışık kaynağının yoğunluğu ile belirlenir. Seyreltik çözeltiler için floresan yoğunluğu, florofor konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Daha yoğun ışık kaynakları, dijital sinyal filtreleme teknikleri ve hassas emisyon fotometrelerinin kullanılmasıyla, floresan ölçümlerinin hassasiyeti, absorbans ölçümlerinin hassasiyetinden 100-1000 kat daha fazla olabilir.
Floresan uygulamaları
Floresan ölçüm tekniklerini kullanan testler, klinik laboratuvarda porfirinleri, ilaçları, hormonları, spesifik proteinleri ve antikorları belirlemek ve hücre fenotiplemesi için rutin olarak kullanılır.
Kullanılan yöntemler, yayılan ışığın doğrudan ölçülmesini ve floresan polarizasyonu, zamanla çözülen floresan, lazerle indüklenen floresan/akış sitometrisi ve seroloji laboratuvarlarında floresan mikroskopisi gibi teknikleri kullanan çeşitli immünoanalizleri içerir.
Florimetreler
Şekil 41.4, basit bir florimetredeki optik düzenlemeyi göstermektedir. Uygun uyarma dalga boyu kaynaktan süzülür ve küvette tutulan çözeltiye yönlendirilir. Ortaya çıkan flüoresan ışığı her yöne yayılır, ancak ortaya çıkan ışığın, emilmeyen kısmı küvetten geçen ve bir ışık tuzağına giren gelen ışına dik açılarda izlenmesi olağandır.
Emisyon dalga boyu, yayılan veya ikincil ışıktan seçilir ve ışın, genellikle bir fotoçoğaltıcı olan dedektöre yönlendirilir. Bunun çıktısı gerektiği gibi güçlendirilir ve işlenir. Amplifikatör kazancı ve uyarı kaynağı sabitse, flüoresan çıktı okuması konsantrasyonla doğrusal olarak ilişkilidir. Bir spektroflorimetre, dalga boyu seçimi için filtreler yerine monokromatörler kullanır.
Birinci nesil florimetreler genellikle cıva buharlı lambalar kullandı. Bu lambaların çıkışları, uyarma dalga boyu seçimini sınırlayan, nispeten az sayıda kesin olarak tanımlanmış bantlarda yoğunlaşmıştır.
Neredeyse sürekli bir spektruma sahip yüksek yoğunluklu bir kaynak, ksenon arkıdır. Ancak bu kaynak ozon üretir ve çok sıcak çalışır. Özellikle klinik pazarı hedefleyen çoğu florimetre, ya bir tungsten halojen ampul ya da daha fazla hassasiyet için hızlı ateşleyen bir ksenon flaş tüpü kullanır.
Kemiluminesans veya benzeri
Kemiluminesans nedir
Kemilüminesans yöntemi
Kemiluminesans ELISA
Kemilüminesans
Kemilüminesans prensibi
Elektrokemilüminesans
Elektrokemilüminesans nedir
Çift ışınlı spektroflorimetreler
Bu aletlerde, kaynaktan gelen ışık demeti kesilir ve numune küveti ile referans küvet arasında bölünür. Her küvet tarafından üretilen floresan, kıyıcı ile elektriksel olarak fazlandırılmış tek bir fotoçoğaltıcı tüp tarafından izlenir. Fark sinyali, referans küvette üretilen flüoresansın çıkarılmasına izin verir ve ayrıca lamba sapmasını ve titremeyi telafi eder.
Floresan polarizasyon analizörleri
Bu aletler, temel olarak, bir dizi uyarma ve emisyon ışığı polarizörünün takıldığı filtre florimetreleridir. Floresan yoğunluğu, uyarma ışınının düzlemine hem paralel hem de dik olarak ölçülür. Floresan depolarizasyon derecesi, moleküler boyutla ilgili olan moleküler rotasyona bağlıdır.
Bu teknik homojen (ayrışmayan) immünolojik testlere uygulanmıştır. Bu uygulamalarda, tipik olarak, bir antijen ve bir flüoresan etiketli antijenin bir antikor üzerindeki bağlanma bölgeleri için rekabet ettiği rekabetçi bir bağlanma immünoanalizi yapılır.
Floresan etiketin yavaş dönen büyük antikora bağlanması, floresan ışığının yüksek oranda polarize kalmasına neden olacaktır. Tersine, bağlanmamış floresan etiketli antijen daha hızlı dönmekte serbesttir ve depolarize floresan üretecektir.
Bu tipteki bazı klinik florimetreler, yalnızca bir floresan türünün ölçümüne adanmıştır. Örneğin, Abbott TDx1 analizör sistemi, yalnızca floresan etiketli immünolojik test reaktiflerini kullanır.
Floresein görünür bölgede emdiği için, bir tungsten halojen ışık kaynağı kullanılabilir. Diğer florimetrik tekniklerle karşılaştırıldığında, duyarlılık düşüktür ve yalnızca küçük moleküllerin tahliline uygulanabilir. TDx1 polarizasyon analizörünün çalıştırılması nispeten basittir ve terapötik ilaç izleme için yaygın olarak kullanılır.
Zaman çözümlü florimetreler
Floresan bazlı immünolojik testler (özellikle homojen testler) ile sıklıkla karşılaşılan bir problem, kan numunelerindeki bazı bileşenlerin (örneğin serum proteinleri, bilirubin ve NADH) neden olduğu yüksek arkaplan floresansıdır.
Uzun floresan bozunma süreleri (> 500 ns) olan zamanla çözümlenmiş ölçümlerin ve etiketlerin kullanılması bu sınırlamayı iyileştirmiştir. Bu tekniği kullanarak, analitten gelen floresans, yalnızca arka plan floresansı bozulduktan sonra izlenir. Yüksek düzeyde floresan lantanit şelatları kullanan otomatik sistemler, çok çeşitli immünolojik testler için ticari olarak mevcuttur.
Perkin-Elmer AutoDELFIA1 sisteminde ölçüm, öropyum şelatları için 1000 ışık/saniye darbesi sağlayan zaman çözümlü bir florimetre ile yapılır. Dedektör, her alıntı darbesinden sonra 400 mikrosaniye (ms) açılır ve yayılan ışığı 613 nm’de 400 ms boyunca toplar. 10 14 mol/l lantanit şelatlarına kadar düşük tespit limitleri mümkündür.
Kemilüminesans
Kemilüminesans, floresandan farklıdır, çünkü uyarma olayı fotolüminasyondan değil, kimyasal veya elektrokimyasal reaksiyondan kaynaklanır. Işık emisyonunun fiziksel olayı, uyarılmış bir singlet durumundan meydana gelmesi ve elektron temel duruma geri döndüğünde ışığın yayılması bakımından floresansa benzer.
Kemilüminesans genellikle luminol, akridinyum esterleri veya lusiferin gibi bir organik bileşiğin bir oksidan (örneğin hidrojen peroksit, hipoklorit veya oksijen) tarafından oksidasyonunu içerir; oksidasyon reaksiyonunda oluşan uyarılmış üründen ışık yayılır.
Bu reaksiyonlar genellikle enzimler (örn. alkalin fosfataz, yaban turpu peroksidaz), metal iyonları veya metal kompleksleri gibi katalizörlerin varlığında gerçekleştirilir.
Luminometreler
Kemilüminesans immünolojik testleri, kimyasal reaksiyon sırasında ışık yayan ışıldayan bileşiklerin kullanımına bağlı olduğundan, gelen bir ışık kaynağına gerek yoktur. Tek sinyal, ışıldayan moleküllerden kaynaklanır ve sonuç olarak, yüksek sinyal-gürültü oranı nedeniyle, bu testler potansiyel olarak çok hassastır.
Prensipte, bir reaksiyon küveti ve ışık geçirmez bir bölme içinde bulunan hassas bir ışık ölçüm cihazından oluşan enstrümantasyon nispeten basittir.
Kemilüminesans uygulaması
Kemilüminesans deneylerinden gelen ışık emisyonunun doğası, tam olarak zamanlanmış reaktif ilaveleri ve çok tekrarlanabilir karıştırma prosedürleri gerektirir. Bu nedenle, uygulamaları, en azından rutin laboratuvarda, özel otomatik immünoassay analizörlerinde kullanımla sınırlıdır.
İmmünoanalizde etiket olarak kullanımları artık küresel teşhis pazarının bu önemli sektörüne hakimdir. Ticari olarak temin edilebilen spesifik kemilüminesans tekniklerinin örnekleri aşağıda verilmiştir. Kemilüminesans immünolojik testleri hormonları, spesifik proteinleri ve belirli ilaçları ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Elektrokemilüminesans Elektrokemilüminesans nedir Kemilüminesans Kemiluminesans ELISA Kemiluminesans nedir Kemilüminesans prensibi Kemiluminesans veya benzeri Kemilüminesans yöntemi