Glikosilasyon Dolgusu – Farmasötik Analiz İçin Kapiller Elektroforez Yöntemleri – Ayırma Teknolojisi – FARMASÖTİK ANALİZ – Kimya Mühendisliği – Ayırma Teknolojisi Ödevleri – Kimya Mühendisliği Ödev Yaptırma – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Hunt ve Nashabeh’in yöntemi kullanılarak hazırlanan hem indirgenmiş hem de indirgenmemiş rodamin etiketli rMAb numunelerinin CE-SDS profilleri Şekil 1’de gösterilmektedir. İndirgenmemiş numune için, gözlenen ana zirve sağlam antikordur. Çeşitli rMAb fragmanlarının ve agregalarının veya daha yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) türlerin diğer daha küçük zirveleri de gösterilmiştir. DTT ile tedavi üzerine, rMAb esas olarak LC, NGHC ve HC’ye indirgenir.
İndirgenmiş örneğin CE-SDS profili ayrıca LC’den hemen sonra daha küçük bir tepe ve tam olarak indirgenmemiş antikorun konumunda yer değiştiren diğer küçük tepeler gösterir. Bu yöntem, bir rMAb farmasötikinin serbest bırakılması için kontrol sisteminin bir parçası olarak kullanılmak üzere Uluslararası Uyumlaştırma Konferansı (ICH) kılavuzlarına göre doğrulanmıştır.
CE-SDS ile bir rMAb’nin Glikosilasyon Dolgusu
Karbonhidratların bir dizi biyolojik olayda önemli ve merkezi bir role sahip olduğu bilinmektedir. RMAb’ler gibi glikoprotein bazlı terapötikler için, proteinin ağır zinciri üzerinde bulunan oligosakaritler, bunların in vitro biyolojik aktivitesini etkileyebilir. Ek olarak, monoklonal antikorların antikora bağımlı hücre aracılı ve tamamlayıcıya bağlı sitotoksik aktiviteleri için glikosilasyonun gerekli olduğu gösterilmiştir.
Bu durumlarda, ilaç geliştirme aşamasında ve ayrıca piyasa için düzenleyici onaydan sonra glikosilasyon doluluk derecesini ölçmek için analitik yöntemlere sahip olmak zorunludur. CE-SDS’de ayırma, protein-SDS komplekslerinin moleküler veya hidrodinamik boyutuna dayanır.
Karbonhidratlar, hidrodinamik boyutlarında proteinlere kıyasla nispeten büyük olduklarından, CE-SDS’deki migrasyon süresi üzerinde bir etkiye sahip olmaları beklenmektedir. Glikosilasyonun, CE-SDS’de antikorların hareketliliği üzerindeki etkilerini göstermek için, bir rMAb, PNGase F enzim sindirimi ile deglikosile edildi ve ardından UV saptamasıyla CE-SDS ile analiz edildi.
Hem indirgenmiş hem de indirgenmemiş rMAb numuneleri için (Şekil 2), iki deglikosile formun zirveleri, sağlam antikor veya ağır zincir üzerindeki karbonhidratların çıkarılması üzerine hidrodinamik boyuttaki azalma nedeniyle daha erken göç zamanlarına kaymıştır. . PNGase F ile muamele edilmiş rMAb’lerin% 50 (ağırlık / ağırlık) ve% 2 (ağırlık / ağırlık) ortak karışımları da, CE-SDS’nin çözülme gücünü değerlendirmek için analiz edildi.
Şekil 2’de gösterildiği gibi, deglikosile edilmiş tepe noktası, sadece deglikosile ve glikosile edilmiş rMAb’nin% 50 (w / w) karışımını içeren indirgenmemiş numunelerde çözülebilir. Diğer yandan, glikosile edilmemiş ağır zincir (NGHC) zirvesi, hem% 50 hem de% 2 (ağırlık / ağırlık) ortak karışımlarda temel olarak çözüldü.
Azaltılmış örneklerin geliştirilmiş çözünürlüğü, düşük seviyelerde bile glikosilasyon doluluğunun daha güvenilir, doğru ve tekrarlanabilir kantifikasyonunu kolaylaştırır. Bu, terapötik rMAb’lerin üretimi sırasında imalat tutarlılığını izlerken CE-SDS’nin SDS-PAGE’ye göre sunduğu önemli bir avantajdır.
N-bağlı glikozilasyon
Protein saflaştırma metotları
Afinite kromatografisi nedir
Protein saflaştırma yöntemleri nelerdir
Glikoprotein
Protein saflaştırma yöntemleri ppt
Protein izolasyonu
Glikozaminoglikan çeşitleri
Düşük Düzeyde Safsızlık Algılama
Ürünle ilgili olmayan safsızlıkları tespit etmek amacıyla CE-SDS yönteminin değerlendirilmesi gerçekleştirildi.11 Yöntemin seçiciliği, hücre kültürü işlemi sırasında mikrobiyal büyüme ile kontamine olmuş reddedilmiş bir numunenin analizi ile gösterildi. Hem indirgenmiş hem de indirgenmemiş numunelerin CE-SDS analizinden elde edilen elektroferogramlar Şekil 3’te gösterilmektedir.
Kirliliklerin varlığı, kontamine olmuş örnekte kontrol rMAb’ye kıyasla iki ek pikin varlığı ile belirgindi ve not edildi. Bu örnek, terapötik rMAb’lerin proses gelişimi ve üretimi sırasında üretim tutarsızlıklarını tespit etmek için CE-SDS metodolojisinin pratik bir uygulamasını açıkça göstermektedir.
NUMUNE HAZIRLAMASININ CE-SDS VE
RMABS’IN SDS-SAYFA ANALİZİNE ETKİSİ
Elektroforetik analizden önce SDS-protein kompleksleri oluşturmak için geleneksel numune hazırlama koşulları, yüksek sıcaklıklarda (ör. 90 ° C) ısıl işlemi içerir. İndirgenmemiş rMAb’ler durumunda, bu, disülfür indirgemesi ve değişim reaksiyonlarına atfedilen termal olarak indüklenen fragmantasyon formunda numune hazırlama yapaylığına yol açabilir. Ayrıca, yüksek pH’ın (W9.0) aynı disülfür yeniden karıştırmadan dolayı antikorların parçalanmasını da arttırdığı bildirildi.
Beklendiği gibi, bu yapılar, bir rMAb numunesinin gerçek temsilini önemli ölçüde değiştirebilir ve ayrıca tahlilin değişkenliğini artırabilir. Disülfür bağlarının yakındaki -SH sistein kalıntıları grupları tarafından azaltılması ve değişim reaksiyonları, bir monoklonal antikorun diğer alt birimlerine ek olarak serbest hafif zincir (LC) ve ağır zincir (HC) parçalarının varlığının bir açıklaması olarak önerildi.
Diğer yandan, birkaç reaktifin, iyodoasetamid (IAM) ve iyodoasetik asit (IAA) dahil olmak üzere Edman dizileme, kütle spektrometrisi ve SDS-PAGE ile analizden önce tiyollerin korunmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sonuç olarak, bu alkilleyici ajanların CE-SDS analizi için etiketlenmiş indirgenmemiş rMAb numunelerinin termal olarak indüklenen fragmantasyonu üzerindeki etkisinin bir araştırması gerçekleştirildi.
Proteinlerin IAM veya IAA ile alkilasyonunun, sistein bir tiyolat anyonu olarak reaksiyona girmesi nedeniyle 8’den yüksek pH seviyelerinde daha verimli olduğu bildirildi. Alkilasyonun rMAb fragmantasyonu üzerindeki etkisini sistematik olarak anlamak için numune çözeltisinin pH’ı 9.0’da sabit tutuldu. . Ek olarak indirgenmemiş tüm numuneler, CE-SDS analizinden önce 90 ° C’de 5 dakika süreyle su banyosunda inkübe edildi.
Haritalama prosedürleri sırasında peptitleri tamamen alkilleştirmek için kullanılan konsantrasyonlara benzer olan, sırasıyla 10, 40, 80 ve 100 mM alkilleyici ajanın nihai konsantrasyon değerine kadar SDS solüsyonunda farklı miktarlarda IAM veya IAA çözündürüldü.
İndirgenmemiş SDS – rMAb konjugatları, 100 mM Tris-HCl tamponunda (pH 9.0) yeniden oluşturulan etiketli rMAb numunelerinin yukarıda belirtilen farklı konsantrasyonlarda IAM veya IAA içeren SDS solüsyonları ile karıştırılmasıyla hazırlandı. Tüm numunelerdeki nihai SDS konsantrasyonu% 1 (w / w) idi. Kontrol numunesi, alkilleyici ajan içermeyen SDS solüsyonunda etiketli rMAb numunesiydi.
Şekil 4A’da gösterildiği gibi, çözelti içinde 40 mM IAM olan numune için kontrol numunesine kıyasla rMAb fragmanlarına karşılık gelen tepe alanlarında önemli bir azalma gözlenmiştir. Bozulmamış antikorun düzeltilmiş pik alanı yüzdesi (% CPA), alkillenmemiş örnekte% 90.0’dan 40 mM IAM içeren örnekte% 97.0’a yükseldi. Alkilleyici ajan olarak IAA kullanıldığında da benzer sonuçlar elde edildi.
Bununla birlikte, IAA çözeltileri birkaç dakika sonra sarı bir rengin görünmesiyle gösterildiği gibi daha az kararlı olduğu için IAM tercih edilen reaktifti. Numunedeki optimum IAM konsantrasyonunun 40 mM olduğu da belirlendi. 40 mM IAM’den düşük konsantrasyonlarda, bazı indüklenmiş fragmantasyon hala gözlendi.
Afinite kromatografisi Nedir Glikoprotein Glikozaminoglikan çeşitleri N-bağlı glikozilasyon Protein izolasyonu Protein saflaştırma metotları Protein saflaştırma yöntemleri nelerdir Protein saflaştırma yöntemleri ppt