Fiksasyon – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Reaktif sekestrasyonu nedeniyle (aşağıya bakınız), in situ amplifikasyon sırasında primerler, dNTP’ler ve Mg2+ dahil olmak üzere geleneksel solüsyon fazı tekniklerinden daha yüksek konsantrasyonlarda amplifikasyon reaktifleri gereklidir. Özellikle Mg konsantrasyonları, 2.5–5.5 mM’de çoğu uygulama için tatmin edici amplifikasyon meydana gelecek şekilde dikkatli bir şekilde optimize edilmelidir.
Amplifikasyon reaktifi hacimleri, kullanılan hücre preparasyonu/doku bölümünün yüzey alanına bağlı olarak genellikle değişir. Bu önemlidir, çünkü lokalize amplifikasyon başarısızlığına bağlı olarak hacim değişimlerinden dolayı lamın yüzeyinde yamalı amplifikasyon meydana gelebilir. Gene Amp in situ PCR 1000 sistemini kullanırken, tipik olarak 25-50 ml kullanılır.
DNA’nın ilk denatürasyonu, amplifikasyondan önce, permeabilizasyon sırasında veya fiksasyon prosesini takiben gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, amplifikasyon protokolünün başlangıcında gerçekleştirilebilir. Denatürasyon ısı, ısı/formamid veya alkali kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Ek olarak, çoğu araştırmacı yanlış hazırlamayı ve primer oligomerizasyonunu azaltmak için ‘hot start’ PCR kullanımını savunmaktadır ve Nuovo (1994), E. coli’den türetilen tek zincirli bağlayıcı proteinin (SSB) eklenmesini önermiştir. Bu proteinin kesin etki şekli bilinmemekle birlikte, DNA replikasyonu ve onarımında primerin yanlış hazırlanmasını ve oligomerizasyonu önleyerek işlev görür.
Döngü parametrelerinin optimizasyonu, her bir özel tahlil için gerçekleştirilmelidir. Çoğu protokol, istisnai olarak 50 döngü olmak üzere 25-30 döngü amplifikasyon kullanır. Bazı araştırmacılar, her tur arasında primerler ve DNA polimeraz dahil olmak üzere yeni reaktiflerin eklenmesiyle iki ardışık 30 döngü turu gerçekleştirmiştir; bunun bir modifikasyonu, ilk tur sırasında üretilen amplikon içinde “iç içe geçmiş” dahili primerlerin eklendiği “iç içe” PCR’dir. Ancak bu rutin kullanım için önerilmez.
Primer seçimi iki temel strateji etrafında gelişmiştir: tamamlayıcı kuyrukları olan veya olmayan tek primer çiftleri veya çoklu primer çiftleri. Amplikonların lokalizasyonu ve minimum ürün difüzyonunun bariz avantajı ile daha uzun/üst üste binen ürün üretmek için çoklu primer çiftleri tasarlanmıştır. Bununla birlikte, eğer ‘hot-start’ PCR kullanılıyorsa, başarılı amplifikasyonu sağlamak için genellikle tek primer çiftleri yeterlidir.
Azot fiksasyon ne demek
Fiksasyon Ne Demek TIP
CO2 fiksasyonu
Dokuların fiksasyonu
Fiksasyon Nedir dış
Fiksasyon Nedir
Azot fiksasyonu
Kontrast fiksasyonu ne demek
Amplifikasyon Sonrası Sıkı Yıkama ve Amplikon Fiksasyonu
Amplifiye edilmiş ürünün lokalizasyonunu korumak için %4 paraformaldehit ve/veya etanol ile sonradan fiksasyon kullanılabilir. PCR-ISH yapılıyorsa bu aşamada bir oligonükleotid veya genomik prob uygulanır. Maksimum özgüllük, yalnızca amplifiye edilmiş ürünün içindeki dizilere hibritlenen problar kullanılarak elde edilir. Genomik problar bu dizilerle sınırlı değildir ve karşılaştırılabilir sonuçlar veriyor görünmektedir.
Yerinde amplifikasyonun ardından, çoğu protokol, spesifik olmayan boyamaya ve yanlış pozitif oluşumuna neden olabilen dağınık hücre dışı ürünü çıkarmak için sodyum klorür, sodyum sitrat (SSC), formamid ve değişen yıkama sıcaklıklarını kullanan bir amplifikasyon sonrası yıkama adımını içerir.
Yıkamanın “sıkılığı”, kullanılan koşullar kümesiyle tanımlanır (yani, SSC konsantrasyonu, kullanılan formamid yüzdesi ve yıkama sıcaklığı). Araştırmacı, sinyalin: arka plan gürültü oranının maksimum olduğu; ancak hibridizasyon sonrası yıkama sertlikleri ampirik olarak türetilir.
Amplikonların tespiti
İzotopik olmayan işaretler (örneğin biyotin, digoksigenin, floresein) daha yaygın olarak kullanılır ve bir “sandviç” immünohistokimyasal tespit tekniği ile birlikte kullanıldığında, izotopik işaretlere benzer derecelerde tespit hassasiyeti sağlıyor gibi görünmektedir. Bunlar, geleneksel immünositokimyada olduğu gibi, bir adımdan beş adıma kadar olan algılama sistemleri arasında değişebilir.
Ürün son olarak bir renk reaksiyonu (örn. NBT/BCIP veya AEC kromajenler) veya floresan ile görselleştirilir. Nuovo, amplifikasyon sonrası konvansiyonel immünositokimyanın performansını tanımlamıştır, bariz avantajı ürünün ilgili hücre ile birlikte lokalizasyonudur, örn. endotel hücresi veya makrofaj.
Bununla birlikte, bizimki de dahil olmak üzere çeşitli gruplar tarafından bunu yeniden üretme girişimleri hayal kırıklığı yaratmıştır ve çoğu epitopun tekrarlayan termal döngüye dayanmaması muhtemeldir.
Hücre içi DNA PCR testleriyle kullanım için reaksiyon, doku ve saptama kontrolleri
Paralel çözelti fazlı PCR, primerlerin ve/veya Taq DNA polimerazın çıkarılması, alakasız primerler ve/veya problar, bilinen negatif kontroller ve referans kontrol genleri her tahlilde gerçekleştirilmelidir. Gerçekleştirilen kontrollerin sayısı, reaksiyon için mevcut doku/hücre miktarına bağlıdır.
PCR-ISH’de aşağıdaki kontroller gereklidir: (a) referans kontrol geni PCR-ISH, örn. -globin, -aktin, vb; (b) hedef dokuların/hücrelerin DNaz sindirimi; (c) hedef dokuların/hücrelerin RNaz sindirimi; (d) alakasız problu hedef primerler; (e) hedef problu alakasız primerler; (f) alakasız problu alakasız primerler; (g) hedef problu referans kontrol geni primerleri; (h) yalnızca hedef primer bir, (asimetrik hücre içi PCR); (i) yalnızca hedef primer iki; (j) Taq polimeraz yok; (k) primer yok; (l) RT IS-PCR veya RT PCR-ISH’de ters transkriptaz adımını atlayın; (m) PCR-ISH ve RT PCR-ISH için in situ hibridizasyon kontrolleri; ve (n) immünositokimyasal saptama sistemleri için saptama kontrolleri.
PDH gibi tek kopya bir memeli geninin kullanımı dahil olmak üzere referans kontrol genleri, doku bölümü/hücre preparasyonundaki amplifikasyon derecesini değerlendirmek için önemlidir. DNA hedeflerini yükseltirken, DNAazların eklenmesi sinyali ortadan kaldırmalıdır. Bu gerçekleşmezse, sinyal sahte amplifikasyondan kaynaklanmış olabilir veya alternatif olarak RNA/cDNA’yı temsil edebilir.
RNAse ön tedavisi, RNA hedeflerinin [in situ ters transkriptaz (RT) PCR] değerlendirilmesinde zorunludur ve hücresel RNA’dan kaynaklanan yanlış pozitif sinyalleri en aza indirmek için DNA şablonlarının amplifikasyonuna dahil edilmelidir. Grubumuz, RNAase A ve T1 kombinasyonunun üstün sonuçlar verdiğini bulmuştur.
Hedefe özgü prob ile bağlantılı olarak bir referans kontrol gen primer çiftinin kullanılması, hedef prob dizisinin “yapışkanlık” derecesini ve bir yanlış pozitif sonucun oluşturulmasını değerlendirir.
Amplifikasyon karışımına yalnızca bir primerin eklenmesi, sentezlenen ürün miktarında nicel bir azalma ile bir “asimetrik PCR” oluşturur. Alakasız problu alakasız primerler bir sinyal üretmemelidir. PCR-ISH’nin in situ hibridizasyon bileşeninin özgüllüğü, hedefe özgü primerler ile alakasız bir prob kullanılarak değerlendirilir.
Yanlış pozitif sinyallerin üretilmesinde primer-primer dimerizasyonu ve primer oligomerizasyonunun rolü Taq DNA polimerazı hariç tutularak değerlendirilirken, doku kesitlerinde çentikli DNA’nın spesifik olmayan uzamasının katkısı primerlerin dışlanmasıyla incelenir.
İkincisi, ISH-PCR için son derece önemli bir kontroldür. RT-IS PCR değerlendirmesinde, ters transkriptaz adımının atlanması önemlidir. Rutin in situ hibridizasyonda olduğu gibi, hibridizasyon kontrolleri ve tespit kontrolleri, ISH adımının başarısızlığından veya tespit sistemi tarafından dokuların anormal boyanmasından kaynaklanan yanlış pozitif/negatif sonuçları dışlamak için gereklidir.
Azot fiksasyon ne demek Azot fiksasyonu CO2 fiksasyonu Dokuların fiksasyonu Fiksasyon Ne Demek TIP Fiksasyon Nedir Fiksasyon Nedir dış Kontrast fiksasyonu ne demek